基因工程論文13篇
基因工程論文(1)
生物基因論文基因工程的論文：
腦源性神經生長因子基因體外轉染鼠雪旺細胞的生物活性
[摘要]目的探討應用重組腺病毒載體攜帶腦源性神經生長因子（BDNF）基因轉染雪旺細胞（SCs）的可行性及促進外周神經損傷恢復的有效途徑。方法采取6～7天SD乳鼠坐骨神經，利用酶消化法、差速貼壁法分離獲得雪旺細胞，阿糖胞苷與Geneticin聯合應用純化、BPE促進雪旺細胞增殖，獲取大量高純度的雪旺細胞。使用含BDNF基因的重組腺病毒（Ad-BDNF），經不同感染復數（MOI）病毒量感染體外培養的大鼠源性SCs。逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測感染后72 h的BDNF mRNA，ELISA定量分析感染后 3 d、6 d、9 d、12 d、15d、18 d和 21 d時感染后SCs培養液上清中BDNF的表達。
關鍵詞：雪旺細胞基因轉染腦源性神經生長因子
中圖分類號：R329.28 文獻標志碼：B 文章編號：1004-7484（2010）12-0029-03
腦源性神經生長因子（BDNF）是一種重要的神經營養因子，能夠促進創傷后神經的修復與再生和減少神經元的死亡[2]。本研究通過將攜帶有BDNF基因的重組腺病毒表達載體轉染體外培養的雪旺細胞，以檢測BDNF基因的調控表達情況。探索基因治療外周神經損傷的新途徑，為進一步臨床應用治療基因通過腺病毒載體轉染雪旺細胞促進周圍神經損傷修復奠定實驗基礎。
1材料與方法
1.1材料
倒置相差顯微鏡；光學顯微鏡；CO2孵箱；超凈工作臺；高速冷凍離心機；DUR530核酸蛋白分析儀；PCR儀；微型垂直平板電泳槽及電轉移系統；凝膠成像分析系統；酶標儀；DMEM培養液；山羊抗 S-100 多克隆抗體；兔抗 BDNF 多克隆抗體；HRP標記的兔抗山羊IgG抗體；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體；DAB顯色劑；總RNA提取試劑盒；RT-PCR反應試劑盒；DNA Marker DL2000；硝酸纖維素膜；胎牛血清；胰蛋白酶；Ⅰ型膠原酶；阿糖胞苷；多聚賴氨酸；Geneticin；牛腦垂體提取物；SABC試劑盒；兔抗S-100單抗； ECL 試劑；鼠BDNF蛋白ELISA試劑盒。
基因工程論文(2)
基因工程基本條件分析報告（載體）
一、基因工程載體的定義
在基因工程中，通常是把外源DNA片斷利用運載工具送入生物細胞。攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具叫做載體(Vector)。
二、基因工程載體必須具備的基本條件
1. 具有對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）
2. 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點
3. 長度盡可能小，以提高其載裝能力
4. 具有多種單一的酶切位點，容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進入宿主細胞和在細胞中的復制。
5. 具有合適的選擇性標記，當其進入宿主細胞、或攜帶著外來的核酸序列進入宿主細胞都能容易被辨認和分離出來。
三、載體類型
載體的分類：
1.根據來源和性質分類：質粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、噬菌粒載體、病毒載體、人工染色體載體。
2.根據功能和用途分類：克隆載體、表達、測序、轉化、穿梭、多功能載體
四、常用主要載體分析
一、質粒載體
??? 質粒作為一種裸露的，比病毒更簡單的，有自主復制能力的DNA分子，是處于生命與非生命的分界線上。
(一) 質粒的一般生物學特性
質粒（plasmid)是染色體以外能自主復制的雙鏈閉合環狀DNA分子，它廣泛存在于細菌細胞中。在霉菌、藍藻、酵母和不少動植物細胞中也發現有質粒存在。目前對細菌質粒研究的較為深入，在基因工程中，多使用大腸桿菌質粒為載體。
?質粒分子的大小為1~200kb，質粒和病毒不同，它是裸露的DNA分子，沒有外殼蛋白，在基因組中，也沒有溶菌酶基因。質粒可以′友好”的“借居”在宿主細胞中，也只有在宿主細胞中，質粒才能完成自己的復制。同時將其編碼的一些非染色體控制的遺傳性狀進行表達，賦予宿主細胞各種有利的表型。
1．質粒的類型? ??
? 大腸桿菌中現已找到許多類型的質粒，其中對F質粒，R質粒和Col質粒研究的較為清楚。由于這些質粒的存在，寄主細胞獲得了各自不同的性狀特征。簡介如下：
?①F質粒：又叫F因子或性質粒(sex plasmid)。 F因子是雄性決定因子，所以F+細胞又叫雄性細胞，與此相應的F—細胞則叫做雌性細胞。F+細胞的表面可以形成一種叫做性須(pilus)的結構，它促進雄性細胞同雌性細胞進行配對。在合適的條件下，將雄性細胞和雌性細胞混合培養，由于性須的作用，就會形成雌—雄細胞配對。我們稱這種過程為細菌的接合作用(conjugation)。在雌雄細胞配對期間，雄性細胞中的F因子按滾環復制模式，經性須作用進入到雌性細胞。配對之后F—受體細胞獲得了F因子，也變成為F+細胞。
?②R質粒：也稱抗藥性因子。R質粒編碼一種或數種抗菌素抗性基因，此種抗性通常能轉移到缺乏該質粒的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力
③Col質粒：此類質粒編碼有控制大腸桿菌素合成的基因，即所謂產生大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是一種毒性蛋白，它可以使不帶Col質粒的親緣關系密切的細菌菌株致死。
2．質粒的復制類型
??? 一種質粒在一個細胞中存在的數目，稱為質粒的拷貝數。根據宿主細胞所含拷貝數的多少，可把質粒分成兩種不同的復制型。一種是低拷貝數的質粒，稱“嚴緊型”復制控制的質粒(stringent plasmid)，此類質粒每個宿主細胞僅含1~3份的拷貝。另一類是高拷貝數的“松弛型”復制控制的質粒(relaxed plasmid)，這類質粒每個宿主細胞可達到10~60份拷貝。
??? 一種質粒究竟是屬于嚴緊型還是松弛型并不是絕對的，這往往同宿主的狀況有關。同一質粒在不同的宿主細胞中可能具有不同的復制型，這說明質粒的復制不僅受自身的制約，同時還受到宿主的控制。
??? 在一般情況下，質粒的接合轉移能力與復制型及分子大小間有一定的相關性。現歸納如下：
???????????????? 分子量大????????????????????????? 分子量小
??? 接合型質粒?? 拷貝數少?????? 非接合型質粒?????? 拷貝數多
???????????????? 嚴緊型復制??????? ????????????????松弛型復制
3．質粒的不親和性
??? 在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能在同一宿主細胞中穩定地共存，這一現象稱為質粒的不親和性(plasmid incompatibility)，也稱不相容性。例如colEI派生質粒，它們之間是互不相容的，也就是說，這些親緣關系較近的不同質粒，當兩種進入同一細胞后，必定有一種在細胞的增殖過程中，被逐漸排斥(稀釋)掉。稱這些質粒間是不相容的。
??? 彼此不相容的質粒屬于同一個不親和群Gneompatiblity group)。而彼此能夠共存的親和質粒，則屬于不同的不親和群。大腸桿菌質粒現已鑒別出25個以上的不親和群。它們之間是相容的，而同一個不親和群內的質粒是不相容的。
(二) 作為質粒載體的基本條件
以上討論的都是天然質粒，天然質粒的研究在理論上和遺傳學等方面作出了貢獻，但它很難直接作為基因工程的運載體應用。質粒載體絕大多數是以天然質粒為基礎，人工改造和組建形成的實用載體。可根據不同的實驗要求，加以選擇。??
作為理想的質粒載體，應具備以下幾個條件：
(1) 能自主復制，即本身是復制子
(2) 具有一種或多種限制酶的單一切割位點，并在此位點中插入外源基因片段，不影響本身的復制功能；
(3) 在基因組中有1~2個篩選標記，為寄主細胞提供易于檢測的表型特征。
(4) 分子量要小，多拷貝，易于操作。
二、大腸桿菌質粒載體
?1．質粒pBR322質粒
質粒pBR322是經人工構建的一種較為理想的大腸桿菌質粒載體，亦是應用最為廣泛的克隆載體，利用pBR322曾克隆到多種基因，雖然現在已有多種具有更優良特性的新型克隆載體逐漸代替了pBR322在基因克隆中地位，但pBR322仍是人工構建的具有幾乎所有的理想特性的基因克隆載體之一。
（1）pBR322質粒的結構
從pBR322質粒的構建過程，可以知道它是由三個不同來源的部分組成的，
第一部分來源于pSF2124質粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；
第二部分來源于pSC101質粒的四環素抗性基因（tetr）；
第三部分來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori）。
（2）pBR322質粒載體的優點
第一、具有較小的分子量。為了方便起見，大家統一規定pBR322質粒DNA分子核苷酸的計數從EcoRI限制酶的識別位點開始，并公認該序列…GAATTC…中的第一個T為核苷酸1，然后沿著從tetr基因到ampr基因按順時針方向順序計數。因此pBR322質粒DNA分子的正確長度是4363bp。
第二、具有兩種抗菌素抗性基因可供作掛化子的選擇記號。
第三、具較高的拷貝數，而且經過氯霉素擴增之后，每個細胞中可累積1000~3000個拷貝。這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。
2．pUC質粒載體
pUC載體是在pBR322質粒載體的基礎上，組入了一個在其5′—端帶有一段多克隆位點的lacZ′基因，而發展成為具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。
(1) pUC質粒載體的結構
典型的pUC系列的質粒載體，通常包括如下四個組成部分：
（1）來自pBR322質粒的復制起點(ori)；
（2）氨芐青霉素抗性基因(ampr)，但它的DNA核苷酸序列已經發生了變化，不再含有原來的核酸內切限制酶的單識別位點；
(3) 大腸桿菌β—半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α－肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ基因；
（4）位于lacZ′基因中的靠近5′端的一段多克隆位點(MCS ，multiple cloning sites)區，但它并不破壞該基因的功能。
（2） pUC質粒載體的優點
與pBR322質粒載體相比，pUC質粒載體系列具有許多方面的優越性，是目前基因工程研究中最通用的大腸桿菌克隆載體之一。其優點概括起來有如下三個方面：
第一、? 具有更小的分子量和更高的拷貝數?
在pBR322基礎上構建pUC質粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，使其分子大小相應地縮小了許多，如pUC8為2 750bp，pUCl8為2 686bp。同時，由于偶然的原因，在操作過程中使pBR322質粒的復制起點內部發生了自發的突變，導致rop基因的缺失。由于該基因編碼的共63個氨基酸組成的Rop蛋白質，是控制質粒復制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC質粒的拷貝數比帶有pMBl或ColEl復制起點的質粒載體都要高得多，平均每個細胞即可達500~700個拷貝。所以由pUC質粒重組體轉化的大腸桿菌細胞，可獲得高產量的克隆DNA分子。
第二，適用于組織化學方法檢測重組體
第三，具有多克隆位點MCS區，方便簡潔，節省時間。
pUC質粒載體具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點，它可以在這兩類載體系列之間來回“穿梭”。因此，克隆在MCS當中的外源DNA片段，可以方便地從pUC質粒載體轉移到M13mp8載體上，進行克隆序列的核苷酸測序工作。同時，也正是由于具有MCS序列，可以使具兩種不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到pUC質粒載體上。
（3）pGEM系列載體
pGEM系列載體是一種與pUC系列十分類似的小分子的質粒載體。在其總長度為2743bp的基因組DNA中，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ′基因。在后者還插入了一段含多個限制性內切酶的識別序列的多克隆位點。此序列結構幾乎與pUC克隆載體的完全一樣。
三、λ噬菌體載體
l．λ噬菌體的一般生物學特性
λ噬菌體為線形雙鏈DNA分子，長度約為49kb，在λDNA分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端，當λ噬菌體進入細菌細胞后，其DNA可迅速通過粘性末端配對而成雙鏈環狀DNA分子，這種由粘性末端結合形成的雙鏈區域稱為cos位點。λ噬菌體是一個溫和噬菌體，其生活周期有二種不同的類型，即裂解周期和溶源性周期。在裂解周期中，λ噬菌體的DNA分子一旦注入寄主細胞中，便可借助于寄主的復制和轉錄系統的功能，使自身DNA大量復制同時合成大量的外殼蛋白，并組裝成大量(約100個)完整的噬菌體顆粒，最后，使宿主裂解并從細胞中釋放出來。
2．λ噬菌體載體
（1）改造
野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆的載體。主要原因有二：
①λDNA基因組大而且復雜，特別是其中具有許多基因克隆常用的限制酶識別位點(如5個BamHI位點、6個BglⅡ位點和5個EcoRI位點等)；
②λ噬菌體外殼只能接納一定長度(即相當于入基因組大小的75％~105％)的DNA分子。因此，λDNA只能作為小片段外源DNA分子(即2.5kb左右)的克隆載體。這一克隆容量顯然不能滿足大多數基因克隆工作的要求，必須對野生型λDNA進行改造。
（2）類型：
只具有一個限制酶位點可便于外源DNA插入的稱為插入型載體，含有二個限制酶切點，在兩個位點之間的DNA區段可以被外源DNA片段所取代的載體稱為取代型載體。
隨著體外包裝技術和寡聚核苷酸合成技術的發展，人們已經構建了許多帶有多克隆位點的λ噬菌體載體，現在常規使用的λ噬菌體載體，不少既可用作插入型又可用作置換型。總之，多克隆位點的引入不僅極大地擴展了λ噬菌體的克隆范圍，同時還大大地簡化了其操作技術。
3．λ噬菌體載體的主要應用
（1）基因組DNA文庫的構建；
（2）cDNA文庫的構建
（3）大容量載體(如粘粒等)中增殖的大片段外源DNA序列的亞克隆等。
四、 粘粒載體（柯斯質粒載體）
? 1．柯斯質粒載體的構建
??? λ噬菌體克隆外源DNA的能力，雖說其理論上的極限值可達23kb，但事實上較為有效的克隆范圍僅為15kb左右。當然，在一般的情況下，這樣大小的DNA片段已足夠容納一個完整的基因及其兩端的側翼序列(flankingsequence)。然而，大量的研究資料表明，許多基因的分子大小比正常預期的要大得多，有的可達35~40kb甚至更大。柯斯質粒，乃是一類由人工構建的含有且DNA的COS序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。它們兼具有λ噬菌體的高效感染能力和質粒易于克隆選擇的優點，既能像質粒一樣在寄主細胞內復制，也能像λDNA一樣被包裝到噬菌體顆粒中去。其克隆能力為31—45kb，而且能夠被包裝成為具有感染性能的噬菌體顆粒。
2．柯斯質粒載體的特點
第一，具有λ噬菌體的特性。柯斯質粒載體在克隆了合適長度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效地轉導對立噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。進入寄主細胞之后的柯斯質粒DNA分子，便按照λ噬菌體DNA同樣的方式環化起來。但由于柯斯質粒載體并不含有且噬菌體的全部必要基因，因此它不能夠通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒。
第二，具有質粒載體的特性。柯斯質粒載體具有質粒復制子，因此在寄主細胞內能夠像質粒DNA一樣進行復制，并且在氯霉素作用下，同樣也會獲得進一步的擴增。此外，柯斯質粒載體通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重組體分子表型選擇標記，其中有一些還帶上基因插入失活的克隆位點。例如，在pHC79柯斯質粒基因組的PstI限制位點克隆，會導致ampr基因的失活；在BamHI和SalI限制位點克隆，又會造成tetr基因的失活。
第三，具有高容量的克隆能力。正如上面所述，柯斯質粒載體的分子僅具有一個復制起點，一兩個選擇記號和COS位點等三個組成部分，其分子量較小，一般只有5~7kb左右。因此，可以插入到柯斯質粒載體上并能被包裝成立噬菌體顆粒的最大外源DNA片段，即柯斯質粒載體的克隆極限可達45kb左右。這個數字比且噬菌體載體及質粒載體的最大克隆能力都要大得多。同時，由于包裝限制的緣故，柯斯質粒載體的克隆能力還存在著一個最低極限值。如果用作克隆載體的柯斯質粒的分子為5kb，那么插入的外源DNA片段至少得有30kb長，才能包裝形成具感染性的且噬菌體顆粒。由此可見，柯斯質粒克隆體系用于克隆大片段的DNA分子特別有效。
基因工程論文(3)
生物研究性學習結題論文
課題名稱利用基因工程開發生產新一代產品
學生姓名計朝暉、程遂、賽國杰、王沛君、賈璐、雷宗衡
年級、班級高二①班
指導教師雷濤
時間2012年1月31日
【摘要】基因工程是20世紀生命科學領域中最偉大的成就，開辟了生命科學的新紀元。基因工程技術將有力地促進社會經濟的發展，實現人的自由，滿足人類多方面的需要。
【關鍵詞】基因工程；原則；應用
一、基因工程的基本定義
基因工程是按著人們的科研或生產需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遺傳物質，在體外切割，拼接形成重組DNA，然后將重組DNA與載體的遺傳物質重新組合，再將其引入到沒有該DNA片段的受體細胞中，進行復制和表達，生產出符合人類需要的產品或創造出生物的新性狀，并使之穩定地遺傳給下一代。按目的基因的克隆和表達系統，分為原核生物基因工程、酵母基因工程、植物基因工程和動物基因工程。基因工程具有廣泛的應用價值，為工農業生產和醫藥衛生事業開辟了新的應用途徑，也為遺傳病的診斷和治療提供了有效方法。
二、發展的主要原則
1、人本原則
人本原則要求人們在研制、發展基因工程技術的過程中，要有意識地實現人、社會、自然的整體和諧，關注人類本身的持續生存和健康發展。人類與其他生物、非生物環境之間的和諧是人類社會持存的原初條件和人類文明得以延續的基本保障。社會層面中政治、經濟、文化和教育環境等之間的和諧是基因工程技術發展的現實社會條件。實現人的健康發展和社會價值是基因工程技術發展的歸宿。堅持以人為本，關心人的價值、尊嚴、平等、自由和全面發展，應該始終成為基因工程技術發展的首要目標。
2、技術與倫理觀念協同原則
基因工程技術已經成為推動經濟社會發展的重要動因，其迅猛發展必然會影響到人類社會固有的觀念。伴隨著包括基因工程技術在內的現代生物技術的發展和應用，人類社會無論從制度方面還是物質方面都已經發生了很大的變革。由人類社會歷史實踐孵化產生出來的倫理觀念同樣要適應新情況和新變化，以嶄新的姿態解決新問題。
我們在利用基因工程技術改造物質世界的同時，也要分析和改造我們自己的精神世界，從而實現兩個世界的和諧統一。在現代生物技術的輝煌與其人文憂患并存的時代，基因工程技術視野與人文價值視野需要很好地對接，技術的發展與倫理觀念所展現的高度應該是一致的，技術與倫理觀念應該是協同發展的。
3、非功利性原則
這項原則要求人們對待基因工程技術的發展，要適當地超越功利心態并堅決反對任何不切合實際的急功近利。它還要求人們謹慎地對待基因工程技術，采取與傳統技術不同的運作方式，在確保安全性的基礎上，有選擇、有限度地加以利用。例如，由于一般藥物的安全性或毒性試驗對基因藥物不一定適用，加上種屬差異性，基因工程藥物對人的藥理學活性在動物身上就不大可能得到完全、正確的反應。這樣在進行安全性試驗和臨床應用時，就要求有不同于傳統的毒性試驗項目、方法、判斷標準以及防范措施。另外，由于轉基因農作物相對于生態系統來講屬于“外來物種”，必須對其從實驗室走向大田試驗的各個環節中間試驗階段、環境釋放階段、生產性試驗階段進行嚴格的實時監控，并且在其大田種植后也要繼續依照新的標準采取分階段的安全性評價。反之，對基因工程技術過分的功利心態則可能無視這項技術的特殊性、不確定性以及可能存在的風險，導致這項技術的誤用和濫用。
三、基因工程的應用
1、基因工程在工業方面的應用
（1）環保工業
隨著化學工業的迅速發展，產生了為數眾多的化合物。其中不少都是能持久存在的有毒物質，這些物質的存在對人們所處的環境造成了極大的威脅。基因工程技術則有望解決這一難題。科學家通過DNA重組技術得到分解性能較高的工程菌種和具有特殊降解功能的菌株，從而大大提高有機物的降解效率，同時也擴大了可降解的污染物種類。
基因工程的方法可以用于環境監測。據報道，用DNA探針可以檢測飲用水中病毒的含量。還有一些科學家正努力通過基因重組構建新的殺蟲劑，以取代生產過程中耗能多，又易造成環境污染的農藥，并試圖通過基因工程的方法回收和利用工業廢物。凡此種種，都是一些可望取得成功和發展前景十分光明的研究課題。
（2）食品工業和酶制劑工業
基因工程在工業方面的應用具有代表性的是在食品發酵工業中的應用。例如，在醬油制造過程中，可通過克隆米曲霉中的木聚糖酶基因，用反義RNA技術抑制該酶的表達所構建的工程菌株可以釀造出顏色淺、口味淡的醬油。在奶制品生產中，通過轉基因技術將外源DNA導入乳酸菌中可以提高其在發酵過程中的穩定性，提高營養價值并縮短生產周期。
2、農業方面的應用
（1）種植業
基因工程在農業上應用的領域也十分廣闊。基因工程在農業方面的應用主要表現在兩個方面。第一、通過基因工程技術獲得高產、穩產和具有優良品質的農作物。第二、用基因工程的方法培育出具有各種抗逆性的作物新品種。
（2）養殖業
現代養殖業的發展需要大量的動物優良品種，常規育種技術往往需大量的種群和漫長的時間，而轉基因技術的應用具有獨特的優勢，轉基因家畜的實驗首先是從兔、豬、綿羊開始的，目前轉基因牛、豬、兔和羊均已問世。含有人生長激素基因的轉基因豬生長周期明顯縮短，飼料利用率及瘦肉比大幅度提高。
3、基因工程在醫藥衛生領域的應用
目前，基因工程在醫藥衛生領域的應用非常廣泛，主要包括以下兩個方面：
（1）基因工程藥物
用基因工程方法制造的“工程菌”，可以高效率地生產出各種高質量、低成本的藥品。例如，頭孢菌素類抗生素中最重要的是中間7ACA，最近國外報導采用基因工程技術將編碼α酶（酰基轉移酶）的基因直接轉入頭孢菌素C的產生菌株中，使其發酵時直接一步產生7ACA。利用轉基因動物-乳腺生物反應器來生產基因藥物是一種全新的生產模式，與以往的制藥技術相比，具有不可比擬的優越性。
應用轉基因植物生產基因工程疫苗同樣也有著極好的前景。與傳統疫苗相比，這種疫苗生產成本顯著降低、比傳統免疫途徑更有效、比傳統的免疫途徑更安全、易儲存和分發，不需要冷藏設備。此外轉基因植物生產的口服疫苗，不僅提供了疫苗而且提供了營養；特別是香蕉一類水果作轉基因口服疫苗大為廣大兒童所喜歡。
（2）基因工程在醫學臨床上的應用
基因工程在醫學臨床上應用主要包括基因診斷和基因治療。它們為人類及時，有效治療惡性腫瘤和心血管等重大疾病和防治肝炎，艾滋病大規模流行帶來希望。基因診斷技術在診斷遺傳性疾病方面發展得尤為迅速。目前人們已經可以對幾十種遺傳病進行產前診斷。例如，用β-珠蛋白的DNA探針可以檢測出鐮刀狀細胞貧血癥，用苯丙氨酸羥化酶基因探針可以檢測出苯丙酮尿癥。此外，基因診斷技術在腫瘤診斷中的應用也取得了重要成果，例如，用白血病患者細胞中分離出的癌基因制備的DNA探針，可以用來檢測白血病。
基因治療是把健康的外源基因導入有基因缺陷的細胞中，達到治療疾病的目的基因工程的興起，使得基因治療成為可能。一些目前尚無有效治療手段的疾病，如遺傳病、腫瘤、心腦血管疾病、老年癡呆及艾滋病等，可望通過基因治療來達到防治的目的。
【參考文獻】
[1]陳凡,張明國.解析技術:“技術—社會—文化”的互動[M].福州:福建人民出版社
基因工程論文(4)
基因工程藥物
姓名：陳劍云
學號：U201210914
班級：機械學院 測控1204班
摘要：自１９７２年ＤＮＡ重組技術誕生以來，生命科學進入了一個嶄新的發展時期。１９８２年美國禮萊公司推出基因工程胰島素，這是第一個人用基因工程藥物。從那時起，以基因工程為核心的現代生物技術已應用到農業、醫藥、化工、環境等各個領域。基因工程技術的迅速發展不僅使醫學基礎學科發生了革命性的變化，也為醫藥工業發展開辟了廣闊的前景，以ＤＮＡ重組技術為基礎的基因工程技術改造和替代傳統醫藥工業技術，已成為重要的發展方向。
關鍵詞：基因工程 制藥 應用
基因的定義：基因是脫氧核糖核酸（DNA）分子上的一個特定片段。不同基因的遺傳信息，存在于各自片段上的堿基排列順序之中。基因通過轉錄出的信使使核糖核酸（mRNA），指導合成特定的蛋白質，使基因得以表達。
基因工程定義：基因工程又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎， 以分子生物學和微生物學的現代方法為手段， 將不同來源的基因(DNA分子)，按預先設計的藍圖， 在體外構建雜種DNA分子， 然后導入細胞， 以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、 生產新產品。
基因工程藥物定義: 基因工程藥物又稱生物技術藥物,是根據人們的愿望設計的基因,在體外剪切組合,并和載體DNA 連接,然后將載體導入靶細胞(微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞) ,使目的基因在靶細胞中得到表達,最后將表達的目的蛋白質純化及做成制劑,從而成為蛋白類藥或疫苗。
基因工程藥物的發展歷程：自1972年DNA重組技術誕生以來,作為現代生物技術核心的基因工程技術得到飛速的發展。1982年美國Lilly公司首先將重組胰島素投放市場,標志著世界第一個基因工程藥物的誕生。美國是現代醫藥生物技術的發源地,也是率先應用基因工程藥物的國家,其基因工程技術研究開發以及產業化居于世界領先地位。美國已擁有世界上一半的生物技術公司和一半的生物技術專利。據1998年美國藥學會統計,美國FDA已批準了56種生物技術醫藥產品上市,其中絕大多數為基因工程藥物。此外,還有200多種基因工程藥物正在進行臨床試驗,其中至少有1/5的產品將可能在今后10年內上市。基因工程藥物為美國的一些公司創造了豐厚的回報,取得了巨大的經濟效益和社會效益。歐洲在發展基因工程藥物方面也進展較快,英、法、德、俄等國在開發研制和生產基因工程藥物方面成績斐然,在生命科學技術與產業的某些領域甚至趕上并超過了美國。
我國基因工程藥物的研究和開發起步較晚,直至20世紀70年代初才開始將DNA重組技術應用到醫學上,但在國家產業政策的大力支持下,這一領域發展迅速,逐步縮短了與先進國家的差距。1989年我國批準了第一個在我國生產的基因工程藥物———重組人干擾素重組人干擾素αIb,標志著我國生產的基因工程藥物實現了零的突破。重組人干擾素αIb是世界上第一個采用基因克隆和表達的基因工程藥物,也是到目前為止唯一的一個我國自主研制成功的擁有自主知識產權的基因工程一類新藥。從此以后,我國基因工程制藥產業從無到有,不斷發展壯大。截止1998年底,我國已批準上市的基因工程藥物和疫苗產品共計15種，國內已有30余家生物制藥企業取得基因工程藥物或疫苗試生產或正式生產批準文號。至2000年,我國已有200多家生物技術公司,有20多家生產銷售人干擾素、白細胞介素、乙肝疫苗等12種基因工程藥物。
基因工程藥物的本質是蛋白質，生產基因工程藥物的方法是：將目的基因連接在載體上，然后將導入靶細胞（微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞），使目的基因在靶細胞中的到表達，最后將表達的目的蛋白質提純做成制劑，從而成為蛋白類藥或疫苗。若目的基因直接在人體組織靶細胞表達，就稱為基因治療。
基因治療：基因治療就是從遺傳物質本身，即基因入手，不必產生或純化基因的最終產物，而是將基因，通常是通過一個載體直接導入人體，再利用人體自身就具有的基因復制、轉錄與翻譯功能來產生這些產物，達到補充正常基因產物或對抗異常基因的目的。將基因導入哺乳類動物細胞的方法有兩種，一類是理化方法，一類是病毒介導的DNA轉移。
利用基因工程技術生產藥品的優點在于：大量生產過去難以獲得的生理活性物質和多肽；挖掘更多的生理活性物質和多肽；改造內源生理活性物質；可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。
基因藥物的發展前景
與傳統制藥相比，生物制藥有便于大規模生產、利潤高、生產工藝簡單、人力投入少、無污染、生產周期短等優點，因此，隨著人類基因組計劃的實施和科技水平的進一步發展，基因藥物在醫藥市場的比例也將會日益提升，也將越來越影響人類的生活。
基因藥物同時具有高投入、高收益、高風險、長周期的特征。 Frost&Sullivan公司的一份最新報告指出，2004年，全球生物制藥市場的收入為450億美元。到2011年，其有望達到982億美元。據預測，全球第一個用轉基因植物生產的生物藥物可望于2005～2006年上市。隨著公眾認知度的提高和相關法規的逐步完善，用轉基因植物生產生物藥物的市場將飛速增長，到2011年，單美國市場就將達到22億美元。 2002年底到2003年5月間一場突如其來的SARS疫情，再加上2005年度禽流感病毒傳播，席卷了亞洲及加拿大等地。在緊張而又嚴肅的應對這場疫情的過程中，生物制藥又成為醫藥行業人士關注的焦點。
我國生物制品需求巨大，過去的幾年我國企業一直能保持年均15％以上增幅，并且近年來銷售的增長速度有加快的趨勢。據統計，2005年國內生物制品銷售收入總額為157．4億元人民幣，銷售利潤總額為38.7億元人民幣。預計到2006年生物技術工業總產值將達400億到500億元，到2015年總產值可達1100億到1300億元。 我國的生物制藥業將進入一個快速發展的階段,生物醫藥工業將成為醫藥產業增長最快的部分。目前,我國許多省市已將生物制藥作為本地的支柱產業重點扶持。一大批生物醫藥科技園相繼在各地高新技術開發區建成。面對入世帶給我國生物制藥業的挑戰和機遇,專家們預測,在未來若干年,我國的生物制藥業將以超過全球平均增長速度步入高速發展軌道,前景十分廣闊。
基因工程藥物的發展概況
20世紀70年代，隨著DNA重組技術的成熟，誕生了基因工程藥物，高產值、高效率的基因藥物給醫藥產業帶來了一場革命，推動了整個醫藥產業的發展，醫藥產業進入了新的歷史時期。基因藥物經歷了三個階段：第一階段是把藥用蛋白基因導入到大腸桿菌等細菌中，通過大腸桿菌等表達藥用蛋白但這類藥物往往有缺陷，人類的基因在低等生物的細菌中往往不表達或表達的蛋白沒有生物活性。第二階段是人們用哺動物的細胞代替細菌，生產第二代基因工程藥物。第三階段是到了80年代中期，隨著基因重組和基因轉移技術的不斷發展和完善，科學家可以將人們所需要的藥用蛋白基因導入到哺乳動物體內，使目的基因在哺乳動物身上表達，從而獲得藥用蛋白。
基因工程技術制藥展望
基因工程技術在醫藥工業中的應用非常廣泛，利用基因工程技術開發藥物已成為當前.最為活躍和迅猛發展的領域。隨著人類基因組計劃的完成，以及基因組學、蛋白質組學、生物信息學等研究的深入，為醫藥生物技術開拓了一個新的領域，基因工程制藥將有更多機會獲得突破性進展，為保障人類健康做出更大的貢獻。
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基因工程論文(5)
基因工程論文轉基因論文：
植物抗病基因工程研究進展
摘要隨著植物抗病基因的分離,植物抗病機制的分子生物學和植物抗病基因工程取得了重大研究進展。該文就植物抗病基因工程的原理、目的基因、轉化方法等進行綜述,并對植物抗病基因工程的應用前景做了展望。
關鍵詞植物;抗病基因;基因工程;原理;目的基因;轉化方法;前景
中圖分類號S432.23;Q78文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2010)16-0053-02
Advancesinthe ResearchofPlant DiseaseResistanceGeneticEngineering
HE Ming
(Research and Development Center for Fine Chemicals of Guizhou University,Guiyang Guizhou 550025)
AbstractWith the isolation of plant disease resistance genes in recent years,it made significant progress that molecular biology of plant disease resistance mechanisms and genetic engineering of plant disease resistance.The principle,targeting genes,transformation methods and view of application prospect of plant disease resistance genetic engineering were summarized.
Key words plant;disease resistance genes;genetic engineering;principle;targeting genes;transformaion methed;view of application prospect
基因工程論文(6)
基因治療在傳染病防治中的應用研究進展
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[摘要] 傳染病是目前人類所面臨的一類重大疾病，在某些疾病狀態下，人類還未尋找到理想的治療方法，如病毒感染等。現代基因治療是一種應用基因工程技術和分子遺傳學原理，對人類疾病進行治療的新療法。主要是指對致病基因的修正和基因增強及采用外源性細胞因子基因、核酶、基因藥物進行疾病治療的方法。經過幾十多年的發展，技術逐步走向成熟，在傳染性疾病的防治中顯示了重大的臨床應用前景。傳染性疾病的基因治療包括：基因疫苗、RNA干擾、胞內抗體、淋巴基因表達等。
[關鍵詞] 基因疫苗 RNA干擾 胞內抗體 淋巴基因表達
1. 現狀
1.1 我國傳染病現狀 21世紀人類依然面臨著傳染病的挑戰首先，是新發傳染病的挑戰。就全球而言，艾滋病是當前首惡，因其主要通過血液、吸毒、性行為傳播，潛伏期長、隱襲性強、控制難度大；特別是婦女感染率高且可以垂直傳播，嚴重危害兒童的身體健康。由于其病毒極易發生變異，所以到目前為止疫苗仍在試驗階段，缺乏理想的特效藥物，免疫損傷治療難度大，以致非洲個別國家感染人數達其全國人口的一半。我國2003年比2002年發病率上升44．39％，人類免疫缺陷病毒檢出率提高了55％。2004新年伊始在東北亞韓國、日本及東南亞越南、泰國、柬埔寨以及中國和美國部分地區禽流感暴發，導致大量家禽死亡，同時H5N1病毒在人群感染使20多人喪命，又一次引起全球震驚。更有嚴重者，引起瘋牛病(在人類稱為克雅克病)的朊毒蛋白對煮沸等常用消毒方法不起作用，疾病潛伏期長，病死率高達100％。這兩種傳染病不但對人類健康造成了威脅，而且給人的兩種主要食物—— 牛肉、禽肉的供應造成困難。由于人與動物關系的密切，氣候的變化，以及化學物質的廣泛應用，微生物發生變異導致新的傳染病，甚至恐怖主義制作生物武器，人類勢必將面臨更多的新的挑戰。其次，老的傳染病對人類健康的影響同樣不容忽視。以2002年為例，WHO統計全球發生各類傳染病共計356 824 000例次，占各病種總發病數的23．9％，位居第一，死亡共11 122 000例，占19．5％ ，僅次于心血管病? 。這說明就全球而言，特別是發展中國家，傳染病不可忽視。據中國疾病預防控制中心報道，我國傳染病同年發病2 320 764例，死亡4520例，病死率0．0195％ ，均遠低于全球平均水平。但近年除新發傳染病外，傳統性傳染病一些情況值得我們注意：(1)發病數和發病率：我國2002年全國傳染病報告發病數2 440 588例次，發病率比2001年下降了5．74％ ，而2003年發病數2 591 512例次，發病率比2002年上升5．45％ 。(2)死亡例數和病死率：從死亡人數看，2002年死亡4520例，比前一年死亡3576例增加了26．4％ ，且2003年比2002年同期又上升了17．43％ ，增加了1280例。2003年死亡人數中死于SARS者349例，狂犬病1980例，且后者比2002年增加821例，高于SARS。(3)病種分布：2002年和2003年發病數居前3位的均是病毒性肝炎、結核與細菌性痢疾，死亡人數居前3位的是狂犬病、肺結核及病毒性肝炎，其中乙型病毒性肝炎及結核無論發病率及死亡數均居前3位。乙型肝炎療效有限，加上慢性化、肝硬化及部分發生肝癌呈鏈式發展，危害人民健康。同樣，最老的傳染病結核主要由于耐藥增加近年全球復燃，我國亦面臨結核的嚴重挑戰。2003年其余死亡數位居前10位的其他傳染病還有新生兒破傷風、艾滋病、乙型腦炎、SARS、細菌性痢疾、出血熱、流行性腦脊髓膜炎。其中除SARS及艾滋病外，均是老的傳染病控制不力出現反復。兒童傳染病死亡原因以破傷風、中毒性菌痢、麻疹與流行性腦膜脊髓炎為主，說明傳染病主要危害兒童的特點，影響了國家優生優育的大計[3]。
1.2 基因治療研究現狀
1.2.1 多種疾病的基因治療 目前，基因治療的范圍已從過去罕見的單基因疾病擴大至常見的單基因疾病和多基因疾病。遺傳性疾病的基因治療多數屬于單基因缺陷所引起的疾病的基因治療。Fang等以腺病毒為載體，靶向肝細胞對苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺陷癥小鼠模型進行了研究，結果表明小鼠的傷寒表型癥狀得到明顯改善。而un等則通過反轉錄狀病童T淋巴細胞中苯丙氨酸羥化酶(PAH)活性的改變狀況。惡性腫瘤的基因治療已進行了大量的預備性實驗，美國科學家構建了重組的TIL(腫瘤浸潤淋巴細胞)，能表達100倍于正常水平的TNF并應用于黑色素瘤的臨床治療。另外，用表達IL-2、IFN．2和IL廣1的TIL治療神經母細胞瘤及白等的研究工作也已見報道；還有應用反轉錄病毒將毒素基因(蓖麻毒素和脊髓灰質炎病毒素中所含的一種蛋白酶的基因)導人癌細胞內，只在靶細胞內表達毒素并發揮殺傷作用，但對其他細胞毒性較低。對于艾滋病等傳染類基因疾病，有研究將HIV LTR3’、5’寡腺苷酸合成酶雜合基因轉染HeLa．T4+細胞。結果表明：經修飾的帶有CD4受體的細胞具有抗HIV感染的作用。還有將編碼可使艾滋病毒HIV RNA降解的核酶基因轉染人淋巴細胞，從而抑制HIV的傳播。
1.2.2 多種藥物的基因治療隨著對基因治療機制本身的不斷深人探討，用于基因治療的藥物形式也不斷創新。基于三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸("rro)的反基因技術能夠通過阻止基因轉錄和DNA復制而達到治療目的。Cohen等曾用此技術抑制淋巴瘤的bc1．2基因，而Noonberg等以此對乳腺癌的HER2基因進行了相應的探索。基因治療從傳統意義上的DNA治療擴展至RNA水平。有治療作用的目的基因的mRNA已用作體內、體外基因治療的研究。Nair等Is J從腫瘤細胞或活組織分離出mRNA，以其對自身提呈抗原的樹突細胞進行轉染，最終表達出了初始癌抗原(CEA)一T淋巴細胞特異性細胞毒素。Thierry等采用體外轉錄的方式，以GFP為報告基因，研究了mRNA在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、鼠黑色素瘤細胞B16．F10、人海拉細胞(子宮頸癌組織細胞株HeLa)、鼠成纖維細胞Ratl等不同細胞系中的表達狀況，同時還探討了不同轉染試劑對轉染效果的影響，并以蜂毒素肽介導并提高了mRNA的轉染效率。
1.2.3 多種途徑的基因治療在探討不同疾病的發病機制、嘗試不同基因藥物，進行基因治療的同時，有研究者對基因治療的新方法新途徑進行了大膽的探索。斯坦福大學研究組采用轉座子作為基因載體，在患有血友病的小鼠模型上，將來自魚的一種編碼轉座酶的基因與宿主染色體上的凝血因子Ⅸ 基因相連接，使小鼠的血液凝結狀況大大改善。基因槍法被證明能夠介導外源基因快速進人靶器官。Takuji等利用基因槍將成骨蛋白．1基因轉入椎間盤細胞中并使其獲得有效表達。Weiss等利用基因槍將包裹的細菌疏螺旋體OspC蛋白基因打人Balb／c小鼠體內，介導了Th2反應，并與注射方式進行比較，發現基因槍只介導Th2反應而非Thl反應的原因并非是由于相比注射方式其所輸送的DNA數量太少，于CpG的臨界濃度所致。利用消化道大量的黏膜表面以及其中所含有豐富的免疫介導組織，以口服的方式將具有治療或免疫作用的目的基因1199運送到靶器官已成為基因治療領域研究的熱點。在以腺病毒為載體對腸上皮細胞進行轉導的研究中，During等Luj將帶有lacZ基因的腺伴隨病毒口服給乳糖不耐癥的小鼠模型，在祖干細胞、腸道細胞、固有膜細胞中，外源基因的表達可持續六個月。MacLaughlin等用殼聚糖作為運送報告基因(編碼氯霉素乙酰轉移酶基因)的載體，經消化道后在體內得到表達。另外，Sizemore等發現當減毒的志賀氏菌進人細胞傳遞質粒后，質粒編碼的B半乳糖苷酶引起黏膜免疫。Ayub等用減毒的沙門氏菌為載體，攜帶李斯特病菌的單細胞基因毒力因子，對小鼠管飼后發現明顯的細胞毒性及輔助T細胞反應，同時也檢測到特異性抗體的產生[4]。
2. 基因治療的方法
2.1 基因疫苗 基因疫苗及DNA疫苗是20世紀90年代發展起來的第3代疫苗。其原理是將編碼病原體抗原的基因分離純化，克隆至真核細胞表達質粒載體，經皮下、肌肉注射或口服等方式進入機體，基因在體內表達相對應抗原并刺激機體免疫系統產生特異性免疫應答，從而使機體獲得針對病原微生物、病毒的特異性抵抗能力，達到預防和治療傳染病的目的。與傳統的第1代疫苗一減毒、脫毒病原微生物成分及第2代疫苗一基因工程蛋白多肽相比，基因疫苗具有能把抗原以自然狀態形式提供給機體、保護力強、無毒力回復并對不同亞型病原體產生交叉抵抗、易于制備和聯合接種、生產成本低、易于保存和運輸等優點，已成為具有廣泛應用前景的新型生物技術。它不僅可用來預防和治療細菌、病毒、寄生蟲等傳染性疾病，而且在腫瘤、自身免疫性疾病的治療中具有重要的價值。DNA疫苗是利用分子生物學技術，根據編碼抗原堿基序列，設計并合成特異性引物，用RT—PCR方法從病原微生物RNA分離純化抗原基因，再通過限制性內切酶方法將DNA克隆至真核細胞表達質粒載體。通過特定的方法將質粒載體制備成注射制劑或口服制劑。當這種制劑進入機體后通過載體的作用，DNA可進入機體細胞，在細胞內表達。病原抗原滯留于細胞內或分泌到細胞外，滯留于細胞內的抗原可特異性活化CD8+ Tc細胞，分泌到細胞外的抗原可活化CD4+ Th細胞或刺激B細胞產生抗體。因此，DNA疫苗不僅可誘導體液免疫，還可誘導細胞免疫，比傳統疫苗只誘導體液免疫具有顯著的優越性[1] 。
2.2 RNA干擾 RNA干擾主要是利用雙鏈RNA在mRNA水平關閉特異序列基因表達或使其沉默的過程，又稱轉錄后基因沉默(post—transcriptional gene silencing．PT—GS)，能特異性使外源性入侵基因沉默。RNA干擾最早在植物和線蟲細胞中發現，被認為是它們抵抗病毒感染的一種天然免疫防御機制。目前普遍認為其機制是核糖核酸酶首先將雙鏈RNA切割成21～23個核苷酸的片段，然后酶又與片段結合，由這些片段將酶引導至特異的mRNA上，從而降解mRNA，使特異基因沉默，抑制基因表達[1]。
2.3 胞內抗體 胞內抗體是一種基因工程抗體。其方法是采用分子生物學手段，從免疫脾細胞或雜交瘤細胞分離純化抗體VH和VL基因片段。再通過特定的連接肽將VH和VL連接起來，構建單鏈抗體(ScFv)基因，并在基因上加上細胞滯留信號序列，將該基因克隆至真核細胞表達質粒載體，通過特定的方法將質粒載體制備成注射制劑或口服制劑。當這種制劑進入機體后通過載體的作用，DNA可進入機體細胞，表達單鏈抗體定向分布于細胞的核、胞漿或特定細胞器中與病毒蛋白結合，干擾病毒蛋白的分泌、加工和活性，從而阻止病毒復制和病毒顆粒組裝釋放[1]。
2.4淋巴因子轉基因表達 淋巴因子在傳染病治療中具有十分重要的作用和廣泛的應用前景。其中的干擾素（IFN）已成為目前抗肝炎病毒治療唯一公認有效的基因工程藥物。利用淋巴基因表達進行傳染病的基因治療研究，是基因治療在傳染病中的一個重要應用和重要的研究方向[2]。
2.5 反義RNA 彭國平[5]綜述中談到HBV、HCV是引起慢性肝炎以及肝硬化、肝細胞肝癌等相關疾病的重要病原體，而有效防治此類肝病的關鍵在于抗病毒，反義核酸技術最早是人工合成或生物合成特定互補的DNA或RNA 序列導入靶細胞，形成mRNA—DNA 或mRNA—RNA雜交雙鏈，從而抑制或封閉靶基因表達，達到基因控制和治療的目的[5]。
3. 基因治療在傳染病防治中的應用
3.1 DNA疫苗 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因疫苗在國外已進入I期臨床實驗，其結果顯示：該疫苗可在體內有效表達HBsAg，并可誘導強烈的免疫反應，產生高效價抗體，同時，志愿者對疫苗具有良好的耐受性。我國科學家將S抗原基因與IL一2、INF基因連接在同一載體上，構建融合基因給健康小鼠、HBV轉基因小鼠使用后，發現CTL活性顯著升高，HBsAg特異T細胞增殖能力顯著高于對照組，血清抗HBs抗體顯著升高。HIV一1基因疫苗在動物體內可產生有效的免疫應答，減少病毒顆粒釋放和對T細胞的損害，在人體內的實驗證明它可有效誘導抗HIV抗體產生。沙眼衣原體MOMP—DNA疫苗給小鼠免疫后可有效誘導抗體產生，其效價高達1: 1250，脾細胞對衣原體的刺激指數顯著高于對照組，說明該基因疫苗不僅誘導了體液免疫，同時還誘導了細胞免疫[1]。
3.2 RNA干擾(RNAi) 近年來隨著對RNA干擾研究的深入，一種能在哺乳動物細胞中抑制特異基因表達、只有21個核苷酸的小干擾雙鏈RNA(small interfering RNA，siRNA)被發現。將特異的siRNA通過陽離子脂質體轉入Hela細胞和人胚腎293細胞等不同哺乳動物細胞中，獲得了可重復的序列特異的RNA干擾，而將長序列的雙鏈RNA轉入則出現了非特異抑制。這些研究成果為RNA干擾的研制提供了前提。Randall等人發現HCV特異的siRNA可抑制AC和Huh一7肝細胞株中HCV復制，清除細胞內HCV病毒[1] 。
3.3 胞內抗體 在傳染性疾病，尤其是病毒感染中的應用越來越受到人們的關注。抗HIV結構和功能蛋白scFv基因導入HIV感染的淋巴細胞后能干擾HIV病毒轉錄和復制，而對細胞生長和CD4表達無影響，將其導入表達有CD4和CCR的人骨肉瘤細胞，可抵抗HIV的感染。抗HIV逆轉錄酶和抗整合酶的胞內抗體可抑制酶活性，減少病毒復制。抗CCR5和CD4的胞內抗體可抑制CCR5和CD4的表達并防止HIV感染。抗HCV外膜蛋白E2的胞內抗體能抑制病毒與靶細胞結合，發揮治療作用。抗HCV核心抗原的ScFv能抑制核心蛋白功能和HCV的裝配。我國研究者成軍等人報道：將抗HBV核心抗原SeFv基因克隆至逆轉錄病毒載體，構建的重組逆轉錄病毒感染2 215細胞后能有效抑制Ⅶ 和HBsAg的表達[1]。
3.4 干擾素的基因轉移與表達 Seif等將小鼠的干擾素β（IFNβ）的基因置于主要組織相容性復合體（MHC）的啟動子序列的控制之下，構建重組表達載體，轉染Babl/c小鼠的成纖維細胞系NIH3T3，得到了持續的IFNβ的表達。表達IFNβ的細胞系，對濾泡口炎病毒（VSV），腦心肌炎病毒（EMCV）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus）的復制和表達均有明顯的抑制作用。并發現持續低水平的IFNβ的分泌表達，就可以使這一細胞系產生明顯的抗病毒狀態。然而，用等量的外源重組的IFNβ則無此效果。而且，加入相應的IFNβ的單克隆抗體并不能阻斷這種轉導的細胞系對上述三種病毒的抑制效應。因此認為，此細胞系的抗病毒狀態的產生，除了和分泌型IFNβ的表達有關以外，還有可能存在其它的作用方式。另外，Bednarik等將人的α2干擾素（IFNα2）的基因重組到人免疫缺陷病毒（HIV）的長未端重復序列（LTR）中的啟動子下游，轉入非洲綠腎細胞系中，IFNα2的分泌表達水平持續在50~150u/ml之間。這一低水平的IFNα2的表達完全可以抑制HIV的復制和轉錄。同樣地也發現就用相應水平的外源重組的IFNα2也無此效果。而且IFNα2的單抗也不能阻斷IFNα2的抗病毒作用。這一差別的原因，作者認為體內產生的IFNα2與體外重組的IFNα2的抗病毒機理不同。外源重組的IFNα2的抗病毒機理，是抑制HIV的成熟和裝配過程，而內源表達的IFNα2的抗病毒作用，似乎是主要作用在轉錄水平以及HIV mRNA的穩定性等方面[2]。
4 問題與展望
基因治療在染性疾病的體內外實驗生物治療中均顯示了療效。尤其是基因疫苗對機體的保護作用已得到了公認，但其真正進入臨床廣泛應用尚有一段距離。還有許多問題須要進一步的驗證： 4.1 基因疫苗編碼抗原的表達問題。基因疫苗使用時進入機體的是一段DNA片段，其作用的發揮須要DNA在細胞內有效轉錄和翻譯成相應的蛋白，如何能使DNA高效率進入機體細胞并得到高效轉錄和翻譯；
4.2 DNA疫苗目前的動物實驗顯示其免疫效果存在較大的個體差異，總的來看其免疫原性不高
4.3 RNA干擾目前雖然是一個研究熱點，但其研究工作才起步，其導人體內的方法、穩定性等問題還需要解決；
4.4 基因治療的安全性問題，尤其是選用的載體對機體的影響還須要進一步證實，這一問題在短時間內無法解決。
4.5 倫理道德方面的爭論也是影響因素之一。
4.6 基因轉移中的副作用和抗體形成問題。
雖然基因治療還存在如此諸多問題，但它的理論基礎和強大生命力是顯而易見的。經過幾年來的發展，基因治療的研究已逐步從理論走向了臨床的實驗，人們已獲得了不少寶貴的知識與經驗，隨著分子生物學、免疫學的發展，人類及細菌、病毒等基因組測序的完成，為進一步發展和完善基因治療奠定了良好的基礎，相信不久的將來，基因治療將在傳染性疾病的預防和治療中發揮重要作用。
參考文獻
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2. >
基因工程論文(7)
基因工程
( 文獻綜述)
（梁貴欽綜述 郭慧婷審校）
摘要 基因工程是生物工程的一個重要分支，它和細胞工程、酶工程、蛋白質工程和微生物工程共同組成了生物工程。所謂基因工程是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當的工具酶進行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新技術。
關鍵詞 DNA 細胞 人體健康
引言
基因工程又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。基因工程技術為基因的結構和功能的研究提供了有力的手段。
1．基因工程的起源
1866年，奧地利遺傳學家孟德爾神父根據豌豆雜交實驗發現生物的遺傳基因規律，提出遺傳因子概念。1980年科學家首次培育出世界第一個轉基因動物轉基因小鼠。 近二十多年來, 基因工程成為科學研究的焦點之一, 并且取得了長足的進展。
狹義上僅指基因工程，將一種生物體的基因與載體在體外進行拼接重組，然后轉入另一種生物體（受體）內，使之按照人們的意愿穩定遺傳，表達出新產物或新性狀。
廣義上包括傳統遺傳操作中的雜交技術、現代遺傳操作中的基因工程和細胞工程。
是指DNA重組技術的產業化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。
2．各國基因工程研究情況
英國：早在20世紀80年代中期，英國就有了第一家生物科技企業，是歐洲國家中發展最早的。如今它已擁有560家生物技術公司，歐洲70家上市的生物技術公司中，英國占了一半。
德國：德國政府認識到，生物科技將是保持德國未來經濟競爭力的關鍵，于是在1993年通過立法，簡化生物技術企業的審批手續，并且撥款1.5億馬克，成立了3個生物技術研究中心。此外，政府還計劃在未來5年中斥資12億馬克，用于人類基因組計劃的研究。1999年德國研究人員申請的生物技術專利已經占到了歐洲的14%。
法國：法國政府在過去10年中用于生物技術的資金已經增加了10倍，其中最典型的項目就是1998年在巴黎附近成立的號稱“基因谷”的科技園區，這里聚集著法國最有潛力的新興生物技術公司。另外20個法國城市也準備仿照“基因谷”建立自己的生物科技園區。
西班牙：馬爾制藥公司是該國生物科技企業的代表，該公司專門從海洋生物中尋找抗癌物質。其中最具開發價值的是ET-743，這是一種從加勒比海和地中海的海底噴出物中提取的紅色抗癌藥物。ET-743計劃于2002年在歐洲注冊生產，將用于治療骨癌、皮膚癌、卵巢癌、乳腺癌等多種常見癌癥。
印度：印度政府資助全國50多家研究中心來收集人類基因組數據。由于獨特的“種姓制度”和一些偏僻部落的內部通婚習俗，印度人口的基因庫是全世界保存得最完整的，這對于科學家尋找遺傳疾病的病理和治療方法來說是個非常寶貴的資料庫。但印度的私營生物技術企業還處于起步階段。
日本：日本政府已經計劃將用于生物技術研究的經費增加23%。一家私營企業還成立了“龍基因中心”，它將是亞洲最大的基因組研究機構。
新加坡：新加坡宣布了一項耗資6000萬美元的基因技術研究項目，研究疾病如何對亞洲人和白種人產生不同影響。該計劃重點分析基因差異以及什么樣的治療方法對亞洲人管用，以最終獲得用于確定和治療疾病的新知識；并設立高技術公司來制造這一研究所衍生出的藥物和醫療產品。
中國：參與了人類基因組計劃，測定了1%的序列，這為21世紀的中國生物產業帶來了光明。這“1%項目”使中國走進生物產業的國際先進行列，也使中國理所當然地分享人類基因組計劃的全部成果、資源與技術。
三．基因工程的危害
關于轉基因生物的安全性，沒有科學性共識。盡管如此，基因工程農作物已被大規模投放，生物醫學應用也日益增加。轉基因生物還被投入工業使用和環境恢復，而公眾對此卻知之甚少。最近幾年，越來越多的證據證明存在生態、健康危害和風險，對農民也有不利影響。
對此5大洲13個國家的科學家和農業實踐者，于“2014食品安全與可持續農業論壇”中發表宣言
5大洲13個國家的科學家和農業實踐者，在“2014食品安全與可持續農業論壇”中發表宣言
立即暫停一切轉基因農產品的商業化生產，切實禁止在實驗室以外擴散轉基因物種。 開放公眾討論，反對壓制不同觀點，反對壓制獨立科學研究，確保公眾的知情權和發言權。加強對轉基因技術危害后果的科學研究。 保護生物多樣性，把種子的保有和使用權還給種植者和人民。反對種子壟斷。保護人民獲得安全食物的自由，反對少數商業公司的食品壟斷和食物霸權。提倡合理的可持續農業生產模式，讓農業回歸自然。
4．基因工程的益處
一些困擾人類健康的主要疾病，例如心腦血管疾病、糖尿病、肝病、癌癥等都與基因有關。依據已經破譯的基因序列和功能，找出這些基因并針對相應的病變區位進行藥物篩選，甚至基于已有的基因知識來設計新藥，就能“有的放矢”地修補或替換這些病變的基因，從而根治頑癥。基因藥物將成為21世紀醫藥中的耀眼明星。基因研究不僅能夠為篩選和研制新藥提供基礎數據，也為利用基因進行檢測、預防和治療疾病提供了可能。
確定人的基因在23對染色體上的具體位置，查清每個基因核苷酸的順序，建立人類基因庫。1999年，人的第22對染色體的基因密碼被破譯，“人類基因組計劃”邁出了成功的一步。
培養優質、高產、抗性好的農作物及畜、禽新品種，還可以培養出具有特殊用途的動、植物。
5．我國基因工程現狀
由于國家高技術研究計劃（即“八六三”計劃）、攻關計劃和國家自然科學基金會都將生物技術作為優先發展領域予以重點支持，中國基因工程研究水平正在高速發展。
1989年，中國批準了第一個在中國生產的基因工程藥物——重組人干擾素αlb 中國生產的基因工程實現了零的突破。
基因工程制藥產業是典型的技術產業，具有高投入、高風險、高收益的特點。同時，中國基因工程制藥使得這些企業融資能力明顯不足，很難從一般融資渠道獲得企業發展所需的資金發展資金嚴重不足已成為基因工程制藥產業發展的巨大障礙因素。
6．結語
基因工程的高速發展為人們的生活帶來益處如基因工程可以為人類提供治理環境、提取金屬、臨床診斷、基因治療和改良農作物品種等社會服務 ；同時基因工程也存在著不少的隱患，普通老百勝不具備識別監督基因工程的能力、這使得基因工程行業中有不少投機取巧的“黑心”科學家；基因工程的完善之路還是任重而道遠。
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［3］《北京宣言》 [R] 2014.
基因工程論文(8)
生物工程進展論文
姓 名： 胡偉
學 院： 生物科學與工程學院
專 業： 生物工程
班 級： 生工142
學 號： 140302205
基因工程抗體進展
摘要：基因工程抗體是繼多克隆抗體和單克隆抗體之后的第三代抗體，近年來隨著生物工程技術的發展，許多基因工程抗體陸續問世，本文詳細介紹了基因工程抗體的研究進展，概述了基因工程抗體在臨床方面的明顯優勢和應用潛力。
關鍵詞：基因工程抗體；研究進展；臨床引用
轉基因技術迅速發展，其應用和發展的領域日益夸大。但轉基因技術的弊端日益凸現，引起眾多關注的目光。就轉基因技術本身而言，社會各界對它的態度各有異同。不同的國家不同的民族和不同的個體對轉基因技術的態度大相徑庭。如何看待轉基因技術？如何去應用和發展轉基因技術？這些都是我們亟待解決的問題。
1 基因工程抗體介紹
基因工程抗體是借助DNA重組和蛋白質工程技術，在基因水平對免疫球蛋白分子進行切割、拼接、修飾和重新組裝的一種新型抗體。所制備的抗體去除或減少了可引起副作用的無關結構，但保留天然抗體的特異性和主要生物學活性，并可賦予抗體分子以新的生物學活性的總稱。
由于目前制備的抗體均為鼠源性臨床應用時，對人是異種抗原，重復注射可使人產生抗鼠抗體，從而減弱或失去療效，并增加了超敏反應的發生，因此，在 80 年代早期，人們開始利用基因工程制備抗體，以降低鼠源抗體的免疫原性及其功能[2]。目前多采用人抗體的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗體的序列，經修飾制備基因工程抗體，稱為第三代抗體。
將識別效應細胞的抗體和識別靶細胞的抗體聯結在一起，制成雙功能性抗體，稱為雙特異性抗體。如由識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞（CTL細胞、NK細胞、LAK細胞）表面分子的抗體（CD3抗體或CD16抗體）制成的雙特異性抗體，有利于免疫效應細胞發揮抗腫瘤作用。
2 基因工程抗體的研究進展
主要是利用基因重組技術，把鼠抗體的重輕鏈可變區部分與人抗體重輕鏈恒定區的進行重組，減少鼠源結構，增加人源結構，而保持抗體與原抗原的特異性結合。
1.人的Ig重輕鏈可變區基因片段展示在噬菌體表面,組成抗體庫。
2.過噬菌體把抗體的表型和基因型相偶聯，易進行分子克隆和基因操作。
3.抗體庫的來源影響篩選結果（免疫和正常人）。
4.高通量篩選與抗原結合的抗體，但親和力低。
3.基因工程抗體藥物的應用
隨著生物工程技術的發展，許多基因工程抗體 陸續問世，并在醫學領域的許多方面都具應用潛力，如病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病、同種異體移植物注射、哮喘、中風和青光眼治療，尤其在診斷和治療腫瘤性疾病及抗感染方面優勢明顯。
惡性腫瘤的導向治療，是通過重組技術將抗腫瘤相關抗原的抗體與多種分子融合，這些分子在抗體結合靶分子后可提供重要輔助功能．這些分子包括：放射性核素、細胞毒藥物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治療的病毒．對腫瘤治療來說，設計的雙特異性抗體可有效針對低水平的腫瘤相關抗原，并將細胞毒物質輸送到腫瘤細胞．此外，抗體還可與攜帶藥物的脂質體、各種PEG偶聯，從而增強體內運輸和藥代動力學。作為免疫脂質體，轉鐵蛋白受體抗體可使藥物通過血腦屏障到達大腦．抗體酶復合物作為前體藥物也被用于基礎腫瘤治療。
基因工程抗體的進展已使抗體制備技術進入了一個全新時代，尤其藥物抗體庫的進展，解決了人源抗體的研制，促進了各種性能優良抗體以及具有多種功能的抗體融合蛋白的開發，可以預見基因工程抗體的研制正在進入一個新的高峰。但是抗體的親和力減弱，與完整抗體結構相比，功能明顯就會降低。人們對可能出現的新組合、新性狀會不會影響人類健康和環境，還缺乏知識和經驗，按目前的科學水平還不能完全精確的預測。所以我們要在抓住機遇，大力發展基因工程技術的同時，需要嚴格管理，充分重視轉基因抗體的安全性。
【參考文獻】
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基因工程論文(9)
綠色熒光蛋白的應用
09化學制藥 0932220026 唐駿
2008年的諾貝化學獎由日本科學家下村修（Osamu Shimomura）、美國科學家馬丁·沙爾菲（Martin Chalfie）和美籍華裔科學家錢永健（Roger Y. Tsien）因在發現和研究綠色熒
光蛋白方面做出貢獻而共同獲得。
綠色熒光蛋白(green f luo rescen t p ro tein,GFP) 是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白。當受到紫外或藍光激發時, GFP 發射綠色熒光。近年來, 隨著GFP 在各種異源細胞, 如細菌、昆蟲及植物細胞中的表達, GFP 作為一種新型的報告物在生物學界引起了廣泛的關注, 關于它的基本結構、生色團、發光機理及基因的改造均有大量的研究報道。它是一種操作方便, 不用加外源底物, 就能在活細胞中檢測的分子探針。將徹底改觀過去標記方面的研究方法, 在分子生物學研究中有廣闊的應用前景。
關鍵詞：綠色熒光蛋白 轉基因技術
綠色熒光蛋白的發現與發展
1962年， 下村修和約翰森等在《細胞和比較生理學雜志》上報道， 他們分離純化了維多利亞多管水母中的發光蛋白—水母素。據說下村修用水母提取發光蛋白時， 有天下班前， 他將產物倒進水池里。臨出門前關燈， 回望了一眼水池， 見到水池閃閃發光。因為水池也排放有養魚缸的水， 他懷疑是魚缸成分影響了光蛋白。然而不久之后， 他便確定鈣離子能增強光蛋白發光。
綠色熒光蛋白被發現20多年后，才有人將其應用在生物樣品標記上。1993年，馬丁·沙爾菲成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物(如大腸桿菌等）也能產生綠色熒光蛋白，這不僅證實了綠色熒光蛋白與活體生物的相容性，還建立了利用綠色熒光蛋白研究基因表達的基該方法，而許多現代重大疾病都與基因表達的異常有關。至此，生物醫學研究的一場“綠色革命”揭開了序幕。 后來，美籍華人錢永健系統地研究了綠色熒光蛋白的工作原理，并對它進行了大刀闊斧的化學改造，不但大大增強了它的發光效率，還發展出了紅色、藍色、黃色熒光蛋白，使得熒光蛋白真正成為了一個琳瑯滿目的工具箱，供生物學家們選用。目前生物實驗室普遍使用的熒光蛋白，大部分是錢永健改造的變種。
1 GFP在轉基因研究中的應用特點
目前轉基因研究與應用的發展十分迅速，將GFP基因應用到轉基因研究中，具有其它基因所無法比擬的以下諸多優點。
1．1 GFP熒光穩定，易于檢測
GFP的熒光較穩定，抗光漂白能力比熒光素強，能耐受較長時間的光照。GFP在pH7—12范圍內都能正常發光；對高溫(70％)、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數普通酶等都有較強抗性"】。GFP中的發色團是由其一級結構中的一段三肽自然形成，該發色團的形成只需要氧氣，不依賴于酶或者其它輔助因子，僅以紫外光或藍光激發，即可發出綠色熒光。用肉眼、熒光顯微鏡均可以觀察到。且靈敏度高，還可進行表達量的半定量或定量檢測。
另外，GFP中氨基酸的替換可產生不同光譜特性的突變體，且增強了熒光強度，適合在不同物種中專性表達。Tsien卜川發展了顏色迥異的GFP突變體，包括藍色熒光蛋白BFP(blue fluorescent protein)、青色熒光蛋白CFP(eyan fluorescent protein)和黃色熒光蛋白YFP(yellow fluorescent protein)。隨著研究深人，抗酸、抗漂白、亮度高(消光系數與量子產率乘積)、成熟快及單體結構的GFP變體將越來越多，激發和發射光譜范圍也將不斷拓寬，對該蛋白的檢測將越來越容易。
1．2表達調控簡單，構建栽體方便
GFP中的發光團由一些常見的非特異氨基酸構建而成，它的翻譯后修飾過程不需要原有水母(A．victoria)細胞中任何其它成分或共因子，在細胞內呈自主表達。利用GFP發光時，只需要操縱細胞合成GFP蛋白，元需復雜的翻譯后加工過程，GFP就會自動折疊催化并開始發光，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達。由于GFP分子量較小，只含有238個氨基酸，編碼GFP的基因序列也較短，約為2．6 kb¨1，所以它可以很方便地同其它序列一起構建多種載體，而不至于使質粒過大而影響轉化效率。
2 GFP在轉基因研究中的應用進展
2．1 用于篩選轉基因成功個體
外源目的基因轉入宿主后，能穩定整合的頻率低，通常是將攜帶有目的基因的載體轉到若干個宿主中，再從該若干個細胞(或其它)中篩選出成功轉化并表達目的基因的個體。因此，如何準確和有效地區分轉化與非轉化細胞、篩選轉化成功的個體是轉基因研究中重要的一步。在這一步中，科研工作者通常是在目的基因上游加一個篩選標記基因，利用篩選標記基因在移植前進行陽性篩選，僅把陽性細胞移入受體，則可大大提高轉基因動植物的成功率，減少轉基因個體篩選鑒定的工作量。目前常采用的篩選標記基因主要有：氯霉素乙酰轉移酶基因(CAT)，葡萄糖苷酶基因(GUS)，熒光素酶基因(Lue)，新霉素磷酸轉移酶基因(NPT)，潮霉素磷酸
轉移酶基因(HPT)等。利用這些標記基因時，有些需要復雜的樣品固定和制備過程、昂貴的底物；有些需要漫長的抗性篩選，對胚胎有一定的毒害作用；大部分還需要特殊的檢測手段，給轉基因研究工作增加了難度，均不夠理想。而將GFP應用于標記基因，可以避免以上缺陷，能夠有效、快捷的對轉基因個體進行篩選，大大提高了轉基因工作效率。黃國存等¨引分別用花粉管通道法和農桿菌介導法將攜帶有GFP基因的外源基因導入棉花，發現用手持紫外燈結合顯微鏡檢技術能夠快速地對轉化子進行活體篩選鑒定，明顯比GUS檢測方法優越。程在全等¨引用基因槍法將帶有綠色熒光蛋白基因的質粒pJPM5和pSBG700分別轉入水稻TNG67愈傷組織，在熒光顯微鏡下觀察到了綠色熒光蛋白基因的表達，綠色熒光蛋白基因表達出的綠色熒光蛋白信號比植株的自發熒光強得多，且不會受自發熒光的太大影響。因此，綠色熒光蛋白基因可以作為水稻(甚至小麥、玉米)轉基因研究中的報告基因。李華等¨刮將GFP表達質粒導人BHK、DK、RK等真核細胞，建立真核細胞轉基因指示系統，結果表明，GFP的表達對胚胎無損傷，又經濟簡便，可避免B一半乳糖苷酶等報告基因的不足，是提高基因轉移與篩選效率的理想途徑。Vain等第一次對抗生素篩選與GFP篩選進行了直接比較，研究表明GFP能大大提高轉化的工作效率，減少了轉基因植株分子檢測步驟和工作量。
2．2 用于尋找轉基因所需的啟動子、增強子等調控元件
基因的表達調控研究與轉基因研究相輔相成，用轉基因方法可研究基因的表達調控，而基因的表達調控研究可更好地指導并應用于轉基因研究。啟動子、增強子等是基因表達調控的重要元件，也是轉基因所需的組件。用不同的啟動子與GFP基因相連，構成不同的表達質粒，用于轉化合適的細胞，通過觀察細胞的熒光強度，就可以比較判斷啟動子的強弱，找出適合用于轉基因的啟動子。Clontech公司構建了一種叫啟動子報告載體(Promoter reportervector)，即沒有啟動子的GFP質粒，專門用來測試各種啟動子對GFP表達的效率，以及某些增強子對GFP表達的調控效果。用玉米C4PPDK基因5’端的非翻譯片段(5’UTR)與花椰菜花葉病毒的35S啟動子連接，GFP在玉米原生質體中的表達效率比對照質粒(只有35S啟動子)提高近15倍，因為5’UTR片段中含轉錄增強子¨“。將藍氏賈第蟲谷氨酸脫氫酶(GDH)啟動子和GFP構成融合基因，轉化賈第蟲，可以觀到綠色熒光，從啟動子的5’一末端進行逐步缺失，制備一系列突變體并構成融合基因，轉化藍氏賈第蟲，能確定出GDH啟動子核心序列。
2．3 用于探索不同物種的有效轉基因方法
轉基因的方法很多，適用于不同生物的轉基因方法也不同。在做轉基因之前，研究者必須先摸索出最有效的方法，以提高轉基因的成功率。目的基因構建到表達載體上后的表達情況通常是不清楚的(有許多表達條件需要摸索)，一旦檢測不到基因的表達，就很難判斷是轉基因方法不恰當，還是基因表達本身出現問題。所以如果直接用目的基因進行有效轉基因方法的探索，將給轉基因工作帶來很多困難。GFP的表達無種屬特異性、表達調及翻譯后修飾過程簡單易控制、通常表達量也很高，將目的基因替換為GFP基因進行不同生物轉基因最優方法的探索，將會縮小研究難度。
Rolling等¨副將腺相關病毒載體(AAV)與與GFP構建成rAAV．GFP重組質粒，經視網膜下腔注射到大鼠眼內，在整個試驗過程(4個月)中均能觀察到GFP的表達信號，說明AAV能夠有效地轉染視網膜色素上皮細胞(RPE)。Bennett等¨引將攜帶有GFP的cDNA重組腺相關病毒(rAAV)經視網膜下腔注射到成年的免疫活性小鼠眼內，用激光掃描眼底鏡進行觀察，試驗結果表明，rAAV能有效穩定地介導視網膜基因轉移而無明顯的毒性及免疫反應。楊國順等心剛利用GFP基因優化了辣椒的遺傳轉化體系。Hu等嵋川用電激法和PEG法同時轉化玉米和擬南芥菜(Arabidopsis)原生質體，GFP在玉米原生質體中表達，且PEG介導比電激法轉化效率高；而擬南芥菜原生質體中未觀察到GFP表達。但Sheen等糾利用基因槍(Microprojectile bombardment)轟擊擬南芥菜葉片和根組織，觀察到GFP的表達。宋軍等口糾以綠色熒光蛋白基因為目標基因，用脂質體轉染豬胎兒成纖維細胞，并以綠色熒光蛋白基因轉染后的陽性細胞作為體細胞核移植的核供體，以體外成熟卵母細胞為核受體構建了綠色熒光蛋白轉基因克隆豬胚胎，結果表明，脂質體轉染試劑可以高效轉染豬胎兒成纖維細胞，獲得的陽性細胞具有支持豬全程發育的潛能。
2．4提高轉基因產物的利用率
GFP分子量小，它能與多種蛋白質的N端或C端融合，其表達產物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現出與天然GFP相似的熒光特性。許多表達的轉基因產物，特別是一些特殊蛋白，難以分離純化，而將GFP與目的基因進行融合表達，則使分離純化變得容易許多。還有研究表明，改變蛋白質的末端結構，與GFP融合，可以增加重組蛋白質的穩定性ⅢJ。Kaba等∽糾構建了編碼ECF(東海岸熱，牛的一種致死性原蟲病)子孢子表面抗原P67的重組桿狀病毒載體，結果只有低水平的表達，而P67基因與GFP的c端融合則出現較高水平的表達，重組融合蛋白能夠被P67單克隆抗體識別，非融合蛋白蛋白既具有原有的正常功能，又具有綠色熒光特性。岳莉莉等舊釗成功地實現了GFP與HBV(乙型肝炎病毒)抗原基因融合后在大腸桿菌中高效表達，得到既能發射熒光又具有抗原性的雙功能融合蛋白，為獲得一種新型發光免疫診斷試劑奠定了基礎。
結束語
綠色熒光蛋的發光機理比熒光素/熒光素酶要簡單得多。一種熒光素酶只能與相對應的一種熒光素合作來發光，而綠色熒光蛋白并不需要與其他物質合作，只需要用藍光照射，就能自己發光。 在生物學研究中，科學家們常常利用這種能自己發光的熒光分子來作為生物體的標記。將這種熒光分子通過化學方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。生物學家一直利用這種標記方法，把原本透明的細胞或細胞器從黑暗的顯微鏡視場中“糾出來”。 傳統的熒光分子在發光的同時，會產生具有毒性的氧自由基，導致被觀察的細胞死亡，這叫做“光毒性”，因此，在綠色熒光蛋白發現以前，科學家們只能通過熒光標記來研究死亡細胞靜態結構，而綠色熒光蛋白的光毒性非常弱，非常適合用于標記活細胞。
基因工程論文(10)
基因工程
1 基因工程技術簡介
基因工程又稱為DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。它是現代生物技術的核心內容，已成為現代高新技術的標志之一。可以將此技術應用于食品包裝、食品保藏、貯運等中，以改變包裝材料，降低生產成本；延長食物的貯藏期，改變傳統的貯運方式。如通過轉基因技術生產的延熟番茄，主要通過乙烯合成途徑調控，抑制乙烯合成，從而達到延遲成熟、耐貯藏的目的 [1] 。
自從二十世紀七十年代誕生以來, 在短短的幾十年間已得到了迅速的發展和廣泛的應用。它具有從本質上改變生物及食品性能的特性, 因此越來越受到食品科技工作者的重視。基因工程技術在食品領域的應用也取得了豐碩的成果, 并使食品的概念從農業食品、工業食品發展到了基因工程或生物技術食品。可以預言, 在二十一世紀, 以基因工程為核心的生物技術必將給食品工業帶來深刻的革命。
2 基因工程的主要內容
2.1 基因工程的概念
1）狹義的基因工程僅指用體外重組DNA技術去獲得新的重組基因；
2）廣義的基因工程則指按人們意愿設計，通過改造基因或基因組而改變生物的遺傳特性。如用重組DNA技術，將外源基因轉入大腸桿菌中表達，使大腸桿菌能夠生產人所需要的產品。
2.2 基因工程的簡述
基因工程的工具酶在基因工程的操作中起著十分重要的作用，其種類主要有限制性內切酶、連接酶、聚合酶、核酸酶、堿基磷酸酶、逆轉錄酶等，它們正如建筑工程操作中常用的工具一樣，是基因工程操作中必不可少的。
2.3 基因工程操作的基本步驟
1）在供體細胞中用限制性內切酶切割基因，以分離出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制備運載體（質粒、病毒或噬菌體）。其中提取目的基因的方法有直接分離法——鳥槍法，人工合成法包括反轉錄法和根據已知的氨基酸序列合成DNA；
2）把獲得的目的基因與制備好的運載體用DNA連接酶連接組成重組體；
3）把重組體導入受體細胞。在將重組體導入受體細胞前，將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞，目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內就能獲得大量的目的基因；
4）目的基因的檢測和表達，并篩選、鑒定出含有外源目的基因的菌體或個體。
3 基因工程技術在食品工業中的應用
3.1 改造食品原材料
轉基因植物源食品 轉基因植物可被改革而具有抗病蟲害的能力,這具有深遠的經濟意義[2] 。1986 年首次獲得能夠抗煙草花葉病毒的轉基因煙草植株,對煙草花葉病毒的預防效果可達70%。目前利用基因工程不斷獲得了各種抗病毒植株,黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒和Y病毒,抗病蟲害長頸南瓜和抗蟲害轉基因土豆。我國及菲律賓培育出“超級水稻”和“超超級水稻”,為人口日益增長、糧食日益短缺的世界帶來一線光明[3] 。遺傳黑胸大蠊濃核工程作為一種改進生物農藥對densoviruses療效可以提高基因操縱。它奠定了基礎為增加作為控制劑廠生產的densoviruses的潛力保護，矢量控制和城市害蟲控制。[4]
3.2 改良食品營養品質
食品中動植物蛋白由于其含量不高或比例不恰當,可能導致蛋白營養不良。采用轉基因的方法,生產具有合理營養價值的食品,讓人們只需吃較少的食品,就可以滿足營養需求。例如,豆類植物中蛋氨酸的含量很低,但賴氨酸的含量很高;而谷類作物中的對應氨基酸含量正好相反,通過基因工程技術,可將谷類植物基因導入豆類植物,開發蛋氨酸含量高的轉基因大豆。胡永金等以南瓜為主要原料，采用保加利亞乳桿菌和嗜鏈球菌(1∶1)進行發酵制作南瓜發酵飲料，通過正交實驗確定發酵最優工藝條件與配方，結果表明，南瓜漿：水(W／W)為1∶1.75、蔗糖添加量為7％、蛋白糖為0.05％、乳酸菌接種量為5％、發酵溫度為40℃、發酵時間為8h，所得到的南瓜汁乳酸發酵飲料產品，其外觀均一穩定，口感酸甜適中，風味獨特[5]。對碳水化合物的改進,只有通過對其酶的改變來調節其含量。高等植物體中涉及淀粉合成的酶類主要有: ADPP 葡萄糖焦磷酸酶(ADP -GPP) 、淀粉合成酶( SS)和分枝酶(BE) 。通過反義基因抑制淀粉分枝酶可獲得完全只含直鏈淀粉的轉基因馬鈴薯。Monsanto公司開發了淀粉含量平均提高了20% - 30%的轉基因馬鈴薯。油炸后的產品更具馬鈴薯風味、更好的構質、較低的吸油量和較少的油味[6]
3.3 改良微生物菌種的性能
發酵工業關鍵是優良菌株的獲取,除選用常用的誘變、雜交和原生質體融合等傳統方法外,還與基因工程結合,大力改造菌種,給發酵工業帶來生機。 面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。Lancashine[將優良酶基因轉入面包酵母菌中后,其含有的麥芽糖透性酶及麥芽糖的含量比普通面包酵母高,面包加工中產生二氧化碳氣體量提高,最終可生產出膨發性良好和松軟可口的面包。應用基因克隆技術將黑曲霉產糖化酶基因cDNA轉入經優化的受體菌(釀酒酵母京龍JL108 號) , 再經反復篩分、馴化獲得JL1(Yip128D117N) ,經包埋制得具有糖化酒化“雙功能”的固定化酵母,載體產酶能力在10u /g·h以上,酒精發酵醪液中酶活達20u /mL以上[7] 。
3.4 開發保健食品和食品疫苗
食品疫苗就是將致病微生物的有關蛋白(抗原)基因,通過轉基因技術導入植物受體中進行表達,得到具有抵抗相關疾病的疫苗。已獲成功的有狂犬病病毒、乙肝表面抗原、鏈球菌突變株表面蛋白等10多種轉基因馬鈴薯、香蕉、番茄的食品疫苗。英國科學家宣布,未來幾年內,他們將培養一種新型生物雞,這種雞所產的雞蛋里具有抗腫瘤因子,癌癥患者食用雞蛋后體內癌細胞的擴散就會受到抑制。收養T細胞療法已經被設想為未來的治療腫瘤的策略,并對幾十年。在某些疾病建立了那樣的背景粗大的惡性腫瘤,收養T細胞療法可能是一個更好的選擇建立了治療性乙肝疫苗治療疾病。收養T細胞療法是一種策略,潛在的提供較好的控制兩者的數量和質量這個T細胞的反應。潛在的臨床療效在人類T細胞療法收養被多次在動物模型中證實,今后將進一步以用于實際。[8]
3.5 改善食品風味
利用基因工程技術還可以生產獨特的食品香味劑和風味劑,如香草素、可可香素、菠蘿風味劑,以及高級的天然色素,如類胡蘿卜素、花色苷素、咖喱黃、紫色素、辣椒素和靛藍等,并且通過雜種選育的色素含量高、色調和穩定性好。例如轉基因的E1coli的玉米黃素最高產量達289μg/g。通過把風味前體轉變為風味物質的酶基因的克隆或通過發酵產生風味物質都可使食品芳香風味得以增強。另外VB2和VC也都有已經商品化的基因工程產品。Henderson等以質粒pE II 13∶1～DpEHBⅡ作為載體，篩選出了具有分解葡聚糖和糊精的啤酒酵母，這種酵母能夠明顯提高麥汁的分解率并改善啤酒質量。陳美珍等以大豆、牛乳為原料，采中性蛋白酶水解后經脫苦、調配制成多肽保健飲料[9]。曾曉雄報道，在紅碎茶加工中添加蛋白酶可使氨基酸含量提高115%，茶紅素提高20%以上，茶褐素明顯下降，使滋味增強且更醇和，湯色變亮，香氣較好[10]。
4 展望
隨著生物化學和分子生物學的進一步發展,基因工程技術在食品工業中的應用日益廣泛,這極大促進食品工業的發展,也為人類最終解決食物短缺、消除饑餓帶來了希望,在食品工業上的應用具有極為廣闊的前景和美好的未來。但對于發展基因工程技術必須持有謹慎的態度,因為這一高新技術的發展也有可能給人類帶來潛在的負面影響。對于基因工程食品來講,在進人市場之前必須經過充分的毒理學鑒定及安全性評價,向消費者確保它們的質量和安全,同時也需要考慮倫理道德方面的因素,充分尊重消費者的生活習慣。現代基因工程技術將為農業帶來新的綠色生命，只有培育出高產的糧食作物及基因工程食品，才能滿足對食物的需求。未來生物技術不僅有助于實現食品的多樣化，而且有助于生產特定的營養保健食品，進而治病健身；在與環境協調方面，生物技術還有助于食品工業的可持續發展。
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基因工程論文(11)
淺析基因工程技術的應用現狀
動物醫學專業
任課教師 指導教師姓名
摘要: 基因工程作為一門理論性與實踐性較強的學科,其方法與技術已經滲透到現代生命科學的各個分支領域,成為生命科學的一門核心技術。基因工程包含許多獨特的實驗方法和技術,不僅內容豐富,涉及面廣,實用性也強。基因工程是通過DNA 重組技術, 獲得具有特殊生物遺傳性狀和功能的遺傳工具生物體, 基因工程技術廣泛應用于農業、醫學、食品工業等。本文就基因工程的應用現狀綜合闡述。
關鍵詞 : 基因工程; 應用現狀
Shallow gene engineering technology application status
Student majoring in Veterinary Medicine Yinxunqiang
Tutor Minlingjiang
Abstract: Genetic engineering as a door the theory with practical strong subject, the method and technology has penetrated into the modern life science of each branch, become life science and a core technology. Genetic engineering contains many unique experiment method and technique, not only rich content, broad and practical also strong. gene engineering is obtained through DNA recombinant technology, with special biological genetics and function of the genetic tools organisms, genetic engineering technology, widely used in agriculture, medicine, food industry etc. This paper genetic engineering application status of comprehensive elaboration.
Key words: gene engineering, DNA recombinant technology,Application status
0.前言
基因工程技術是一項極為復雜的高新生物技術, 它利用現代遺傳學與分子生物學的理論和方法, 按照人類所需, 用DNA 重組技術對生物基因組的結構和組成進行人為修飾或改造, 從而改變生物的結構和功能, 使之有效表達出人類所需要的蛋白質或人類有益的生物性狀[1]。基因工程從誕生至今, 僅有30 年的歷史, 然而, 無論是在基礎理論研究領域, 還是在生產實際應用方面, 都已取得了驚人的成績。首先,基因工程給生命科學自身的研究帶來了深刻的變化。目前科學家已完成了多種細胞器的基因組全序列測定工作。其次, 基因工程具有廣泛的應用價值, 能為工農業生產、醫藥衛生、環境保護開辟新途徑。
1.基因工程
1.1 概念
基因工程( 又稱DNA 重組技術、基因重組技術) , 是20 世紀70 年代初興起的技術科學, 是用人工的方法將目的基因與載體進行DNA重組, 將DNA 重組體送入受體細胞, 使它在受體細胞內復制、轉錄、翻譯, 獲得目的基因的表達產物。這種跨越天然物種屏障, 把來自任何生物的基因置于毫無親緣關系的新的寄主生物細胞之中的能力, 是基因工程技術區別于其他技術的根本特征。
1.2 基因工程研究內容
(1) 從復雜的生物有機體基因組中, 經過酶切消化或PCR 擴增等步驟, 分離出帶有目的基因的DNA 片段。
(2) 在體外, 將帶有目的基因的外源DNA 片段連接到能夠自我復制并具有選擇記號的載體分子上, 形成重組DNA分子。
(3)重組DNA 分子轉移到適當的受體細胞, 并與之一起增殖。
(4) 從大量的細胞繁殖群體中, 篩選出獲得了重組DNA 分子的受體細胞克隆。
(5) 從這些篩選出來受體細胞克隆, 提取出已經得到擴增的目的基因, 供進一步分析研究使用。
(6) 將目的基因克隆到表達載體上, 導入寄主細胞, 使之在新的遺傳背景下實現功能表達, 產生出人類所需要的物質。
2.基因工程的廣泛應用
2.1 在農業上的應用
2.1.1 抗除草劑的植物基因工程
資料表明, 每年雜草造成的經濟損失占農作物總產值的10%-20%左右盡管除草劑的使用, 對大規模機械化耕作, 減少勞力開支和提高量有極為重要的作用, 但一般除草劑的選擇性較差, 即除了殺草以外, 還會將作物殺死。現在利用生物技術, 將能抵抗除草劑的基因轉移到植物中, 獲得抗除草劑的植物, 如美國的孟山都公司將除草劑草甘磷的靶酶( EPSPS) 的cDNA 克隆轉入油菜[2] , 目前, 已獲得的抗除草劑作物有大豆、棉花、玉米、水稻和甜菜等20 多種。
2.1.2 抗蟲的植物基因工程
生物防治害蟲的工作已經開展多年, 主要是利用蘇云金桿菌中的毒蛋白( 結晶蛋白) 對害蟲有毒害作用, 使用這些桿菌來控制害蟲。現在, 人們可以通過克隆這些毒蛋白的基因(Bt 基因) 并把這些基因轉移到植物細胞中, 從而獲得能抗蟲的轉基因植物。目前, Bt 基因已被轉入煙草、番茄、馬鈴薯、水稻、玉米及棉花等多種植物中。1996 年轉Bt 基因棉花在美國種植66 萬hm2 經中國農科院棉花所引進在華北試種兩年, 在多點表現突出, 在完全不噴殺蟲劑的情況下, 單產仍然高于噴撒2- 3 次殺蟲劑的中國推廣棉花[3] , 顯示出了控制棉鈴蟲的極好前景。
2.1.3 動物轉基因育種
動物基因工程研究主要集中在改良家畜、家禽的經濟性狀和通過轉基因動物進行藥物或蛋白質的生產等方面, 目前已取得了顯著的成就, 先后培育出轉基因豬、羊、牛和魚等, 另一種轉基因豬是帶有人體基因的豬, 這種轉基因豬客望能解決人體移植動物器官的遺體排斥問題。隨著動物基因工程技術的逐漸成熟和轉人體血紅蛋白的基因豬、轉人體血清蛋白的基因山羊等的問世, 不僅能生產出大量人類所需的血紅蛋白、白蛋白等藥物而且為動物育種開辟了一條全新的途徑。
2.2 在醫學上的應用
2.2.1 基因工程藥物
利用基因工程技術開發新型治療藥物是當前最活躍和發展最快的領域。自1982 年世界第一個基因工程藥物- - - 重組胰島素投放市場以來, 基因工程藥物就成為制藥行業的一支奇兵, 每年平均有3- 4 個新藥或疫苗問世, 開發成功的約50 個藥品, 諸如人胰島素、忍尿激酶、人生長激素、干擾素、激活劑、乙肝疫苗等廣泛應用于治療癌癥、肝炎、發育不良、糖尿病和一些遺傳病上, 在很多領域特別是疑難病癥上, 起
到了傳統化學藥物難以達到的作用[4, 5, 6]。為治愈癌癥正在研制的用單克隆抗體制成的“生物導彈”, 就是按照人類的設計, 把“生物導彈”發射出去, 精確的命中癌細胞, 并炸死癌細胞, 而不傷害健康的細胞, 比如專門用于腫瘤的“腫瘤基因導彈”等。可見, 生物工程藥物將成為21世紀藥業的支柱。而脫氧核糖核酸或者基因疫苗的問世, 變革了機體的免疫方式。如今, 人們翹首關注困擾人類的艾滋病病毒疫苗的早日問世。
盡管目前誘變育種技術仍是改良微生物工業生產菌種的主要手段,但是基因工程技術在改良工業生產菌種方面已有成功的報道。最常見的是將控制藥物合成關鍵步驟的酶基因克隆,通過適當的載體轉移到原生產菌中,以使控制限速步驟的酶水平,從而提高產量。Malmberg等[7]構建了一種帶有編碼賴氨酸ε-氨基轉移酶基因( lysine-ε-aminotranster-ase,LAT)這種控制Streptomyces clavuligerus生物合成頭霉素C的限速步驟的關鍵酶的基因(lat)的高拷貝質粒,并轉入這種頭霉素產生菌,使LAT提高活力提高了4倍,在2 L發酵罐中產生頭霉素的能力是原來的2倍,重組菌胞外LAT產物α-氨基己二酸的積累量也比原受體菌高。伊維菌素( ivermectins)是一個市場很大的抗蟲
抗生素,其前體阿弗米丁(avermectins)的產生菌種的發酵液中有8個以上的組分,其中只有B1a組分才是制備伊維菌素的原料。Ikeda等[8]經過近十年的努力,已將阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清,并經過誘變與DNA重組,獲得了僅產阿弗米丁B2a單一組分和B1a、B2a組份的重組工程菌,這不僅大大提高了阿弗米丁有效組分的發酵效價,且給提取、精制、半合成等后處理工序帶來了很大的便利。可以預見,隨著對各種工業生產的微生物藥物生物合成途徑的深入了解以及基因重組技術的不斷進展,應用基因工程方法定向構建高產菌株的成功實例將越來越多。在抗生素發酵過程中供氧往往是一個限制因素,充足的氧氣供給是藥物工業發酵穩定和提高產量,降低成本的關鍵。傳統的解決方法如增加通氣量等對設備要求高,能量消耗大。20世70年代末在專性好氧菌透明顫(Vitreoscilla)中發現了血紅蛋白(VHb),它能促進氧氣擴散到細胞末端氧化酶上。于是人們想到了將其基因Vgb克隆到其它微生物中,以促進微生物在低氧條件下生長。
1988年Khosla等[9]從Vitreoscilla中分離出Vgb基因并將之轉入大腸桿菌(E·coli),提高了大腸桿菌在溶氧量低于5%時對氧的利用率。目前已用克隆表達VHb的方法提高了放線紫紅素、頭孢霉素C、紅霉素等產生菌及青霉素酰化酶基因工程菌的產量[10]。血紅蛋白基因工程的研究和應用,必將對抗生素工業和其它重組藥物發酵工業的節能等帶來美好的前景。作為半合成頭孢菌素類抗生素重要原料的7-氨基頭孢烷酸（7-ACA),目前國內外仍以化學裂解頭孢菌素C的工藝路線為主。國內外已報道可用經由GL-7-ACA的二步法(化學/酶法或二步酶法)來生產7-ACA,與化學裂解法相比不僅收率提高,且能大大減少環境污染,簡化生產工藝。但二步法中關鍵的GL-7-ACA酰化酶在假單胞菌中表達量低而且分離純化困難,限制了這種方法的應用。通過將GL-7-ACA酰化酶基因轉入大腸桿菌中表達恰好可以解決這一問題[11]。最近又報道可將編碼2個酶的基因直接轉入頭孢菌素C的生產菌種中,使其在發酵時直接產生7-ACA。調節基因在藥物的生物合成中也起著重要作用,增加調節基因的基因量能夠大幅提高藥物產量。 Hopwood等將放線紫紅素生物合成的一個調節基因actⅡ導入原產生菌,盡管基因的拷貝數僅增加了2倍,放線紫紅素的產量卻增加了30~40倍。某些抗生素生產菌的產量不高,是由于其自身對該抗生素的抗性不高。因此,利用高拷貝質粒的基因量效應,增加菌種對自身產生的抗生素的抗性,可能增加抗生素的產量。例如,將氨基糖苷-6-乙酰轉移酶基因導入卡那霉素和新霉素產生菌,由于提高了對氨糖類抗生素的抗性,產量提高了2~6倍
2.2.2 基因治療
基因治療是指由于某種基因缺陷引起的遺傳病通過轉基因技術而得到糾正。臨床實踐已經表明: 基因治病已經變革了整個醫學的預防和治療領域。比如白癡病, 用健康的基因更換或者矯正患者的有缺損的基因, 就有可能根治這種疾病。現在已知的人類遺傳病約有4000種, 包括單基因缺陷和多基因的綜合癥。運用基因工程技術或基因打靶的手段, 將病毒的基因殺滅, 插入矯正基因, 得以治療、校正和預防遺傳疾病的目的。目前, 基因治療已擴大到腫瘤、心血管系統疾病、神經系統疾病等的治療[12]。人類也已成功實現了腎、心、肝、胰、肺等器官的移植, 也有雙器官和多器官的聯合移植。
基因治療有兩種途徑: 一是體細胞的基因治療, 一是生殖細胞的基因治療。由于生殖細胞的基因治療操作技術異常復雜, 又涉及倫理緩行之理充足, 故尚無人涉足[13]。基因工程是20 世紀生命科學中最偉大的成績, 開辟了生命科學的新紀元。經過幾十年的發展, 基因工程技術已成為一個巨大的朝陽產業, 它可以超越動物、植物、微生物之間的界限, 創造出新的生物類型。基因工程不僅在醫學上應用廣泛, 而且也廣泛應用在工業、農業、冶金、環保、資源、能源、畜牧漁業等領域, 為人類的豐衣足食和健康長壽提供了持續的實用價值很高的產品, 發展前景極為廣闊。
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基因工程論文(12)
基因工程原理復習題思考題
1、 基因工程的定義與特征。
2、試述基因工程的主要研究內容。
3、基因工程在食品工業上有何應用發展？
4、轉基因是一把雙刃劍，請客觀談談對轉基因及轉基因食品安全性的認識。
1、 原核生物和真核生物的基因表達調控有何差別？
2、 什么是基因？根據基因的產物，基因可分為哪三類？
3、 引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質有何變化？
4、 DNA復性及其影響因素。
1， DNA凝膠電泳中核酸分子分離的機理。
2， DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？
3， PCR的原理和主要反應過程，并分析影響PCR擴增的影響因素。
4， PCR引物設計的原則，若給一指定DNA序列并需要通過PCR擴增此序列，如何設計擴增引物？
5， 定量PCR的原理？Ct值的含義。
6， 分子雜交的類型主要有哪些？探針的標記方法與標記類型？常用的雙鏈DNA的標記方法是哪兩種？
7， Southern雜交一般過程及影響雜交因素。
8， 基因組文庫的構建過程？如何確定文庫的大小？
9， 基因文庫的類型包括哪兩種？各有什么特點？
10， 一般質粒DNA的構型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點？
11， 堿裂解法提取質粒DNA的原理，分析影響試驗結果的各種可能因素。
12， 電泳緩沖液使用一定時間后出現DNA在凝膠中跑不動現象的原因，有何解決辦法？
13， 電泳的指示劑和染色劑有何區別，各自的作用是什么？
1限制性核酸內切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內切酶？
2什么是星活性，產生星活性的因素可能有哪些？
3結合已做的實驗，分析影響酶切的因素。
4限制性核酸內切酶命名規則及各字母代表的含義。
5簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。
6連接酶主要有哪些類型？有何異同點？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？
7試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。
8基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？
1、 作為基因工程載體，其應具備哪些條件？
2、 質粒的不相容性及其分子機理。
3、 載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？
4、 質粒轉化原理，影響轉化率的因素有哪些？
5重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡單闡述其原理
1、 基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DD RT-PCR和SSH，原因請看下題）
2、簡單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優缺點，有何應用？
3抑制性差減雜交的原理與應用。
4酵母雙雜交技術、噬菌體表面展示技術的原理。
5、T-DNA標簽法克隆基因的一般技術路線。
1、通過比較，分析大腸桿菌表達系統和酵母表達系統各有何優缺點。
2、如何提高克隆基因的表達水平？
3、克隆基因目的蛋白的表達的形式主要有哪些類型？
4、啟動子從轉錄模式上可分為哪兩種？表達系統常選用哪一種？其機理是什么？
5、 表達載體和基因工程一般克隆載體在元件構成上有何差別？
6、 根據表達蛋白用途的不同，設計選擇基因的表達策略。
1、什么叫轉基因植物？植物轉基因技術的基本路線主要包括哪些？
2、外源基因導入植物的方法主要有哪些？
3、運用已學的知識，如何全面分析獲得的轉基因個體（提示：包括外源基因是否整合，被插入位點分析，外源基因是否表達，表達量如何？等）
4、出現轉基因沉默現象的可能原因分析。
基因工程緒論
1、基因工程的定義與特征。
定義：在體外把核酸分子（DNA的分離、合成）插入載體分子，構成遺傳物質的新組合（重組DNA），引入原先沒有這類分子的受體細胞內，穩定地復制表達繁殖，培育符合人們需要的新品種（品系），生產人類急需的藥品、食品、工業品等。
特征：1、具跨越天然物種屏障的能力。
2、 強調了確定的DNA片段在新寄主細胞中的擴增。
2、試述基因工程的主要研究內容。
1）、目的基因的分離
2）、DNA的體外重組（載體、受體系統等）
3）、重組DNA分子轉移到受體細胞及其篩選
4）、基因在受體細胞內的擴增、表達、檢測及其分析。
3、基因工程在食品工業上有何應用發展？
主要是通過基因重組，使各種轉基因生物提高生產谷氨酸、調味劑、酒類和油類等有機物的產率；或者改良這些有機物組成成分，提高利用價值。
4、轉基因是一把雙刃劍，請客觀談談對轉基因及轉基因食品安全性的認識。
轉基因技術所帶來的好處是顯而易見的，在人類歷史進步和發展中起到了積極作用。
首先，通過該項技術可以提供人們所需要的特性，改良培育新品種；
第二，延長食品保存時間或增加營養成分；
第三，將抗蟲防菌基因轉入到作物中，使作物本身產生抵抗病蟲害侵襲的能力， 減少了農藥的使用量，有利于環境保護；
第四，轉基因技術及基因食物在醫學方面得到廣泛研究和應用。
人們對轉基因技術的主要擔憂在于環境方面。外源基因的導入可能會造就某種強勢生物， 產生新物種或超級雜草、損害非目標生物、破壞原有生物種群的動態平衡和生物多樣性，也即轉基因生物存在潛在的環境安全問題。
轉基因作物的大面積種植已有數年， 食用轉基因食品的人群至少有10億之多，但至今仍未有轉基因食品對生命造成危害的實例；更何況目前每一種基因工程食品在上市前，都要經過國家法律認可， 食品衛生部門和環境部門的嚴格檢測。只有測試合格了，才能投放市場。因此公眾完全可以安全地消費、大膽地食用轉基因食品。
第一章??? DNA的分子特性與利用
5、 原核生物和真核生物的基因表達調控有何差別？
1）原核基因表達調控的三個水平：轉錄水平調控、翻譯水平調控、蛋白質加工水平的調控
原核基因表達調控主要是在轉錄水平上的調控。
2）真核生物基因表達的特點：
● 1．基因組DNA存在的形式與原核生物不同；
● 2．真核生物中轉錄和翻譯分開進行；
● 3．基因表達具有細胞特異性或組織特異性；
● 4．真核基因表達的調控在多個水平上進行：DNA水平的調控、轉錄水平調控、轉錄后水平調控、翻譯水平調控、蛋白質加工水平的調控；
6、 什么是基因？根據基因的產物，基因可分為哪三類？
基因是具有生物學功能的、在染色體上占據一定位置的一段核苷酸序列，是分子遺傳的功能單位。
根據基因的產物，基因可分為三類：
● 轉錄并翻譯編碼蛋白質的基因:
包括結構蛋白基因、編碼酶的基因、調節基因
● 轉錄但不翻譯產物的基因:
包括tRNA、rRNA
● 不轉錄但有功能的DNA區段:
如啟動子、操縱基因
7、 引起核酸變性的因素主要有哪些？核酸變性后性質有何變化？
引起核酸變性的因素：--溫度、酸、堿、甲醛和尿素等。
DNA變性后，它的一系列性質發生變化，如紫外吸收(260 nm)值升高（增色效應）, 粘度降低等，如DNA增加25－40%. RNA約增加1.1%。。
8、 DNA復性及其影響因素。
變性DNA在適當的條件下，兩條彼此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結構，這一過程稱為復性。
DNA復性的程度、速率與復性過程的條件有關，也與它本身的組成和結構有關：分子量越大復性越難。濃度越大，復性越容易。
（附加：注意：將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。但是將變性的DNA緩慢冷卻時，可以復性。
復性的應用：核酸的雜交，分子擴增）
第二章??? 基因工程操作的基本技術
1. DNA凝膠電泳中核酸分子分離的機理。
在堿性環境下，核酸分子帶負電荷，在外加電場的作用下，分子在凝膠多孔性剛性濾孔中從負極向正極泳動，其中主要由于分子篩效應和電荷效應達到分離不同大小核酸分子的目的。
2. DNA凝膠電泳中影響電泳遷移率的因素主要有哪些？
1）分子本身的影響
分子的大小：小則快
帶電荷數：多則快
分子構型：超螺旋>解螺旋
2）電場：直流電場
電壓高則快
電壓太高則結果不準確
常用3~5V/CM
3）支持物介質
種類：瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠
凝膠濃度: 濃度大，篩孔小，適合小分子電泳；濃度小，篩孔大，適合大分子電泳
4）電泳緩沖液
pH值：偏堿性，帶負電荷
離子濃度：離子濃度高 電流大發熱快膠溶解
種類：TAE、TBE、TPE、TNE
3. PCR的原理和主要反應過程，并分析影響PCR擴增的影響因素。
PCR原理：變性溫度下， DNA雙鏈變性雙螺旋解開成單鏈DNA，在退火溫度中人工合成的特異引物根據堿基互補配對原則與單鏈DNA特異結合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸溫度下不同的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則在引物的引導下合成與模板DNA互補的新鏈，實現DNA的擴增。
影響PCR擴增的影響因素：
§(1)Taq酶：常用1U/25μL
濃度低，擴增產物不夠；
濃度高，非特異性擴增增加；
酶的活性；
§(2)dNTP的濃度：常用100-200μmol/L，不能低于20μmol/L，特異性、保真性；
§(3)模板：主要考慮純度及使用量，對純度要求不高，但含有酚、氯仿等雜質則難以成功。使用量從幾個ng到100ng.
§(4)引物濃度：0.1-0.5μmol/L之間，過多則非特異擴增增加，形成引物二聚體；
§(5)Mg2+濃度：常用 0.5-2.5mmol/L；
影響：酶的活性、引物-模板退火、特異性
§(6)PCR反應程序設定：變性溫度和時間、引物退火溫度Tm與時間、引物延伸溫度與時間和循環數
4. PCR引物設計的原則，若給一指定DNA序列并需要通過PCR擴增此序列，如何設計擴增引物？
引物設計原則：
1、G+C含量45-55%；
2、Tm值高于55；
3、引物特異性；
4、引物擴增跨度；
5、是否形成引物二聚體
5. 定量PCR的原理？Ct值的含義。
原理：通過實時檢測PCR每一個循環擴增產物相對應的熒光信號，來實現對起始模板進行定量及定性的分析。
初始模板量X0的對數值與C(T) 值之間呈線性關系：log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log N
Ct值的含義是：每個反應管內的熒光信號開始由本底進入指數增長階段時到達設定的域值時所經歷的循環數（如后圖所示，圖僅供參考）
6. 分子雜交的類型主要有哪些？探針的標記方法與標記類型？常用的雙鏈DNA的標記方法是哪兩種？
探針的標記方法：切口平移法、隨機引物合成法，末端標記法，PCR標記法，體外轉錄標記法。
探針按核酸分子分：DNA探針和RNA探針；
按標記物的不同：放射性標記探針和非放射性標記探針。
標記類型：按核酸分子的不同：可分為DNA探針和RNA探針
根據標記物的不同：可分放射性標記探針和非放射性標記探針；
雙鏈DNA探針標記主要方法：切口平移法、隨機引物合成法；
7. Southern雜交一般過程及影響雜交因素。
Southern雜交操作步驟:
(1) 用限制性內切酶酶切DNA, 經凝膠電泳分離各酶切片段；
(2) 轉膜：將DNA片段轉移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上；
(3) 預雜交：封阻濾膜上非特異性位點；
(4) 雜交：讓探針與同源DNA片段特異性結合；
(5) 洗脫：去除非特異性結合的探針；
(6) 自顯影檢查目的DNA所在的位置。
Southern雜交影響因子
1）、目的DNA在總DNA中所占的比例
2）、探針的大小和標記效率
3）、轉移到濾膜上的DNA量
4）、探針與靶DNA的同源性
8. 基因組文庫的構建過程？如何確定文庫的大小？
基因組文庫的構建過程：
1）從生物體提取大片斷的基因組DNA；
2）用適當的限制性內切酶（常為4堿基識別位點）進行部分酶切或超聲波打斷基因組DNA ；
3）在瓊脂凝膠電泳上或蔗糖梯度離心篩選適當長度的DNA片斷（根據載體的要求）；
4）載體的酶切、回收；
5）將處理好的基因組DNA片斷與載體連接；
6）將重組子導入宿主細胞
7）文庫的鑒定、收集、保存；
確定文庫大小的方法：
以在構建的基因組文庫中任一基因存在的概率來衡量文庫的質量或完備性，它與基因文庫最低所含克隆數N（即文庫大小）之間的關系可用下式表示：
N = ln ( 1 – P ) / ln ( 1 – f )
其中：
N：文庫所需的總克隆數；
P：任一基因被克隆（或存在于基因文庫中）的概率；
f：克隆片段的平均大小/ 生物基因組的大小。
9. 基因文庫的類型包括哪兩種？各有什么特點？
10. 一般質粒DNA的構型有哪幾種？在瓊脂糖凝膠電泳中的有何特點？
超螺旋質粒DNA、開環質粒DNA、線狀質粒DNA
在瓊脂糖凝膠電泳的特點是：電泳的泳動速度由大到小分別是：
超螺旋質粒DNA>線狀質粒DNA>開環質粒DNA
11. 堿裂解法提取質粒DNA的原理，分析影響試驗結果的各種可能因素。
堿裂解法原理：在堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結構破壞變性，環狀超螺旋質粒不充分變性。在中性條件下變性質粒恢復原來構型，而線性大分子細菌DNA不能復性呈不溶物而經離心除去。
（各種可能因素是上一屆的，具體其實大家可以根據那天師兄說的去寫）
提取失敗：1）洗去雙鏈時，將質粒DNA洗去；
2）破壁失敗，質粒沒析出；
3）加劑問題
電泳失敗：1）電壓太高 2）沒加染色劑
3）膠穿孔 4）電泳時間過長
12. 電泳緩沖液使用一定時間后出現DNA在凝膠中跑不動現象的原因，有何解決辦法？
原因：電泳緩沖液的離子的富集作用；
解決方法：1.更換成新配置的電泳緩沖液；
2.把電泳槽中的緩沖液倒出混勻后再重新使用
13. 電泳的指示劑和染色劑有何區別，各自的作用是什么？
指示劑一定要在電泳前加入，指示劑一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400組成載樣緩沖液；（一般為：溴酚蘭，二甲苯青）
作用：①預知電泳的速率及方向；②使樣品呈現顏色，便于加樣；
③一些高濃度蔗糖或其它物質增加DNA的密度，可以防止DNA的擴散
染色劑即可以在電泳前加入樣液，又可以電泳后再對凝膠染色；（溴化已錠[EB]、硝酸銀、Goldview染料）
作用：呈現出核酸電泳后的帶型。
第三章 基因克隆的酶學基礎
1、 限制性核酸內切酶的類型，基因工程常用的是哪種限制性核酸內切酶？（常用II型）
2、 什么是星活性，產生星活性的因素可能有哪些？
在非最適合的條件下酶的識別特異性降低，產生非特異性帶，這種活性稱星活性。
產生Star活性的因素：（書上P46-P47答案）
高濃度甘油，堿性pH，存在Mn2+，低離子強度，低鹽濃度，低pH
3、 結合已做的實驗，分析影響酶切的因素。（這個答案是上屆的，僅供參考）
1）DNA的純度：DNA中的雜質如蛋白質、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都會影響酶的活性。
2）DNA的甲基化程度 ：dam甲基化酶（修飾GATC中的A）； dcm甲基化酶（修飾CCA/TGG的C）。
3）溫度 ：不同的限制性內切酶的最適反應溫度不同。大多數是37 oC，少數要求40-65 oC。4）緩沖液(Buffer)：是影響限制酶活性的重要因素。
MgCl2、NaCl/KCl：
提供Mg2+和離子強度；
Tris-HCl：
維持pH；
二硫蘇糖醇（DTT）：
保持酶穩定性；
牛血清白蛋白BSA等：
有助于酶的穩定；
β－巰基乙醇：
保持酶的穩定性，防止酶失活
4、 限制性核酸內切酶命名規則及各字母代表的含義。（例子和圖幫助大家理解而已）
命名規則：寄主菌屬名的第1個字母＋種名的前兩個字母＋菌株或菌型代號（大寫）＋空白＋發現序列（羅馬數字）
例子：EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發現次序)
5、 簡單敘述同尾酶和同裂酶的差別。
同尾酶：來源不同，識別的序列不同，但能切出相同的粘性末端，連接后不能被相關的酶同時切割。
同裂酶：識別序列相同，切割位點有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶
（PS：完全同裂酶：識別位點和切點完全相同。
不完全同裂酶：識別位點相同，但切點不同。）
6、 連接酶主要有哪些類型？有何異同點？影響連接酶連接效果的因素主要有哪些？
類型：DNA連接酶和RNA連接酶
異同點：
相同點：都能以DNA為模板，從5"向3"進行核苷酸或脫氧核苷酸的聚合反應。
不同點：DNA聚合酶識別脫氧核糖核苷酸，在DNA復制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在轉錄中起作用。
影響因素：（影響因素就四個，后面分析覺得煩的話大家自己看著辦啦）
1）連接所用的目的片段的狀態：
效率：粘性末端>平端(100倍)；
5，突出>3，突出；
平端：HaeIII>AluI>HinCII>SmaI
2）連接溫度
連接效果最好在37 ℃，但形成的互補不穩定;
最佳連接溫度：12-16 ℃，較好的連接效果，互補又較穩定;
3）反應液中的成分：
ATP：反復凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝；
單價離子：150-200mM NaCl，提高連接效果；
PEG：5%以下可以提高連接效率
4）插入片段與載體的濃度比例
載體DNA與外源DNA的分子摩爾比通常為1﹕3左右，甚至1﹕10 或更高。
目的或作用：增加插入片段與載體的接觸機會，減少載體自我連接的現象。
7、 試分析提高平端DNA連接效率的可能方法。（傳說中的網上答案）
1、低溫下長時間的連接效率比室溫下短時間連接的好。
2、在體系中加一點切載體的酶，只要連接后原來的酶切位點消失。這樣可避免載體自連，應該可以大大提高平端連接的效率。
3、足夠多的載體和插入片段是最重要的 。
4、平端的連接對于離子濃度很敏感
5、盡可能縮小連接反應的體積
6、建議放在四度冰箱連接兩天效率更高比14度好
8、 基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？
1）大腸桿菌DNA聚合酶
2）Klenow fragment
3）T7 DNA聚合酶
4）T4 DNA聚合酶
5）修飾過的T7 DNA聚合酶
6）逆轉錄酶
7）Taq DNA聚合酶
第四章 基因克隆的載體系統
7、 作為基因工程載體，其應具備哪些條件？
具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）；
具有合適的篩選標記；
具有較高的外源DNA的載裝能力；
具有多克隆位點（MCS）；
具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點。
8、 質粒的不相容性及其分子機理。
● 定義：任何兩種含有相似復制子結構的不同質粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現象稱為質粒的不相容性。
● 分子機理：兩種含有相似復制子結構的不同質粒，在復制同時受到同一種拷貝數控制系統的干擾，致使兩種質粒的最終拷貝數不同，其中拷貝數多的質粒在以后的細胞分裂周期中更具優勢。
9、 載體的類型主要有哪些？在基因工程操作中如何選擇載體？
基因工程中常用的載體(vector)主要包括質粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經人工構建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進行篩選的標志基因、單一的限制酶切點等。
10、 質粒轉化原理，影響轉化率的因素有哪些？
A、 化學法（CaCl2法)轉化原理：是Ca2+與細菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結構，后者經熱脈沖發生收縮作用，使細胞膜出現空隙，質粒或DNA重組分子便可進入細胞內（感受態細胞）。
B、 電穿孔轉化轉化原理：將待轉化的質粒或DNA重組連接液加在電穿孔轉化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場，在強大電場的作用下，細菌細胞壁和細胞膜產生縫隙，質粒或DNA重組分子便可進入細胞內。
影響轉化率的主要影響因素:
1）載體本身的性質及其空間構象：超螺旋構象轉化率最高；
2）插入片段的大小：插入片段越大，轉化效率越低；
3）受體細胞的類型及預處理；
4）轉化方法：電擊法高于化學法。
5、重組體分子的選擇方法主要有哪些？并簡單闡述其原理。
從總體上看，重組體分子的選擇與鑒定方法基本上可以分為如下幾個類型：
（1）基于載體遺傳標記檢測法
在構建基因工程載體系統時，載體DNA分子上通常攜帶了一定的選擇性遺傳標記基因，轉化或轉染宿主細胞后可以使后者呈現出特殊的表型或遺傳學特性，據此可進行轉化子或重組子的初步篩選。
（2）基于克隆DNA序列檢測法
Southern印跡雜交：根據毛細管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉移并結合在適當的濾膜上，然后通過與已標記的單鏈DNA探針的雜交作用以檢測這些被轉移的DNA片段。
（3）基于外源基因產物檢測法
如果目的基因產物能降解某些藥物使菌株呈現出抗性標記，或者基因產物與某些藥物作用是顯顏色反應，則可根據抗性或顏色直接篩選含目的基因的克隆子。
6、用已學過的重組體分子的選擇與鑒定技術，試設計一個試驗方案，假如一特異PCR擴出的基因或基因片斷重組進T載體并轉化大腸桿菌，如何鑒定并獲得真實轉化子？(自理)
第五章 基因的克隆一般方法
1、基因的克隆方法主要有哪些？并闡述其克隆原理（至少3種，都是書上找的，自選哈，建議必選DD RT-PCR和SSH，原因請看下題）？
1）差減雜交（SH）
通過DNA復性動力學原理富集目的基因序列，并以此構建減數文庫的方式來進行目的基因分離克隆的。
2）抑制性差減雜交（SSH）
SSH的核心技術是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟結合為一體的技術。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅趕子之間的共同序列，使檢測子和驅趕子之間不同的序列得到擴增。
3）差異顯示PCR（DD RT-PCR）
利用真核生物mRNA結尾處有POLY（A）結構，在其3`端設計象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數的十二分之一結合，從而使這部分基因得到逆轉錄，同時結合5`端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。
4）DNA代表性差異分析（DNA RDA）
代表性差別分析是通過突變型（驅趕DNA，driver DNA）與野生型（檢測DNA，tester DNA）基因組之間的差異來分離和鑒定突變基因的方法。
5）擴增限制性片段長度多樣性（AFLP）
基因組DNA經過限制性內切酶消化后，產生粘性末端。使用人工合成的短的雙鏈接頭，該接頭一端具有同樣的內切酶識別粘性末端，互補連接后成為DNA模板。接頭和與接頭相鄰的酶切片斷的幾個堿基序列作為引物的結合位點。
[參考文獻：關德軍.AFLP技術原理及其在植物研究中的應用.安徽農業科學，2006，34（15）：3625-3628）]
6）cDNA微陣列
建立一套統一且具有高質量、高代表性的cDNA列陣膜，在這一列陣膜上每個cDNA克隆都有固定的位置和編號，這樣大大方便了數據的綜合比較分析，并可對每個cDNA克隆子進行定量分析。在列陣雜交的基礎上，還可以進行雜交測序，從而測定每個cDNA克隆子的序列。
2、簡單闡述差異顯示PCR克隆基因的原理及其優缺點，有何應用？
主要原理：利用真核生物mRNA結尾處有POLY（A）結構，在其3`端設計象5`-T11GA樣引物，該引物可與mRNA總數的十二分之一結合，從而使這部分基因得到逆轉錄，同時結合5`端的隨機引物（20條10-mer），可以使不同長度的基因得到擴增。
優點：
● 簡便、靈敏、高效、省時，能快速顯示mRNA的組成。
● 所需的mRNA量少。
● 各樣本mRNA的差異可同時進行比較。
● 擴出的cDNA可直接用于測序、文庫篩選等。
缺點：
● 假陽性條帶多，對低豐度的基因表達不容易檢測。
● 工作量大。
● 無法定量研究。
● 擴出的條帶往往是3`端比較短的UTR區的一段序列，提供的信息較少。
利用該技術，目前已有越來越多的差別表達基因得以分離和鑒定，在分子生物學和基因工程研究領域發揮了極大的作用。（P221）
3、抑制性差減雜交的原理與應用。
原理：SSH的核心技術是抑制性PCR，它是一種將檢測子cDNA單鏈標準化步驟和消減雜交步驟結合為一體的技術。其中標準化步驟均等了檢測子中的cDNA單鏈豐度，而消減雜交步驟去除了檢測子和驅趕子之間的共同序列，使檢測子和驅趕子之間不同的序列得到擴增。
應用：
基因突變體的研究：如基因的表達與不表達；
基因時空表達的研究：如根、莖、葉；
不同處理條件下的基因表達差異：如施肥與不施肥、光照與不光照。
4、酵母雙雜交技術、噬菌體表面展示技術的原理。
A．酵母雙雜交技術原理：大部分真核生物的位點特異轉錄激活因子通常具有兩個可分隔開的結構域，一個是DNA特異結合域（DNA-binging domain,BD），一個是轉錄激活域(transcriptional activation domain,AD)。這兩個結構域各具功能，互不影響，但一個完整的、具有激活特定基因表達的激活因子必須同時含有這兩個結構域，否則無法完成其激活功能。不同來源的激活因子的BD區與AD區結合后則能特異地激活BD結合基因的表達。
B．噬菌體表面展示技術原理：當外源DNA片段插入絲狀噬菌體基因組的一個外被蛋白基因中時，如果兩者讀碼框結構保持一致，這個外源DNA片段所編碼的產物可與此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表達，并顯示在噬菌體的表面。利用抗此外源基因編碼產物（多肽或蛋白）的抗體，通過親和純化，就能從大量的噬菌體中富集、分離出含有所要的基因的融合噬菌體。然后，通過基因擴增，得到大量所要的目的基因。
5、T-DNA標簽法克隆基因的一般技術路線。
? 農桿菌侵染植物得到轉化苗，篩選出表現某種突變性狀的個體。
? 建立突變體基因組文庫及野生型基因組文庫.
? 用T-DNA片段做probe篩選突變體文庫，獲得陽性克隆。
? 用獲得的陽性克隆篩選野生型基因組文庫，獲得野生型的陽性克隆。
? 把陽性克隆轉化突變體進行功能互補及進行測序分析。
第七章 克隆基因的表達
1、通過比較，分析大腸桿菌表達系統和酵母表達系統各有何優缺點。
大腸桿菌表達外源基因的優勢：
全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架；
基因克隆表達系統成熟、完善；
繁殖迅速、培養簡單、操作方便、遺傳穩定；
被FDA批準為安全的基因工程受體生物。
大腸桿菌表達外源基因的劣勢：
缺乏對真核生物蛋白質的復性功能；
缺乏對真核生物蛋白質的修飾加工系統；
內源性蛋白酶降解空間構象不正確的異源蛋白；
周質內含有種類繁多的內毒素。
甲醇酵母表達系統的優點：
? 具有強的受嚴格調控的AOX1啟動子
? 表達蛋白的翻譯后的加工和修飾
? 營養要求低，工業化生產成本低
? 可高密度發酵
? 表達蛋白可存在于胞內和胞外
酵母表達系統的缺點：酵母表達蛋白有時會出現蛋白切割問題（這個找不到，百度的）
2、如何提高克隆基因的表達水平？
1）、表達載體的優化設計；
2）、提高目標基因mRNA和目標基因產物的穩定性；
3）、密碼子偏愛性；
4）、表達環境條件的優化。
3、克隆基因目的蛋白的表達的形式主要有哪些類型？
表達蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白兩類，具體包括如下幾種結構形態：包涵體型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白
4、啟動子從轉錄模式上可分為哪兩種？表達系統常選用哪一種？其機理是什么？
啟動子從轉錄模式上分為：組成型啟動子和誘導型啟動子
表達系統常選用誘導型啟動子
機理：指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。
11、 表達載體和基因工程一般克隆載體在元件構成上有何差別？
表達載體：啟動子；終止子；核糖體結合位點（SD序列）；篩選標記；復制子（質粒拷貝數）；多克隆位點
克隆載體：篩選標記；復制子（質粒拷貝數）；多克隆位點
12、 根據表達蛋白用途的不同，設計選擇基因的表達策略。
（1）表達蛋白用于生物化學和分子生物學研究 ——主要考慮保持蛋白質原有的功能不變；表達策略：融合表達和直接表達
（2）表達蛋白用作抗原——主要考慮表達蛋白的快速提純；表達策略：以包涵體形式合成目的蛋白和融合表達目標蛋白（不用去除標簽蛋白）
（3）表達蛋白用作結構研究——表達蛋白以天然可溶形式產生；表達時考慮因素：表達溫度（高溫促進包涵體的形成）；表達水平（高表達促成包涵體的形成）；表達載體受體菌。
第八章???植物基因工程
1、什么叫轉基因植物？植物轉基因技術的基本路線主要包括哪些？
利用DNA重組技術，在離體條件下對不同生物的DNA進行加工，并按照人們的意愿和適當的載體重新組合，再將重組DNA轉入生物體或細胞內，并使其在生物體內或細胞中表達的植物。
植物轉基因技術的基本路線
● 分離目的基因
● 目的基因與恰當的載體DNA形成重組DNA
● 重組DNA的擴增
● 目的基因導入到受體細胞
● 篩選轉化細胞，誘導產生轉基因植株
● 轉基因植株的大規模種植
2、外源基因導入植物的方法主要有哪些？
物理方法：電擊法、基因槍法(biolistic)、顯微注射法、微激光束法
化學方法：PEG介導法、脂質體介導法
生物學方法：農桿菌介導法、花粉管通道法
3、運用已學的知識，如何全面分析獲得的轉基因個體（提示：包括外源基因是否整合，被插入位點分析，外源基因是否表達，表達量如何？等）
對轉基因個體進行檢測與鑒定的對象
——報告基因
——目的基因
(1)基因組水平的檢測與鑒定（外源基因是否整合，被插入位點分析）：可以用PCR擴增結合Southern Blotting進行驗證。
(2)基因的轉錄/表達水平的檢測與鑒定(外源基因是否表達):可用RT-PCR法或者Northern Blotting。
(3)基因的翻譯水平的檢測與鑒定（表達量）：可用Western Blotting或者ELISA。對報告基因來講，還可以利用報告基因的顯色或發光特性進行選擇與 鑒定
4、出現轉基因沉默現象的可能原因分析。
(1)位置效應：指插入部位及其周圍序列對外源基因的影響
(2)DNA甲基化：包括編碼序列和啟動子的甲基化
(3)重復序列誘發基因沉默：多拷貝串聯重復序列易引起外源基因的失活；
(4)共抑制（co-suppression）：具有部分同源性的外源基因和植物內源基因相互作用引起的沉默現象。
轉基因食品的危害有哪些
轉基因食物的五大隱患
雖然轉基因食品研究歷史只有短短幾十年，但其提高產量、增強自身抗病抗蟲等優點較為明顯，另一方面，其潛在的風險，如過敏性、毒性及對環境影響也令世人關注。
首先是毒性問題。一些研究學者認為，對于基因的人工提煉和添加，可能在達到某些人們想達到的效果的同時，也增加和積聚了食物中原有的微量毒素。
其次是過敏反應問題。對于一種食物過敏的人有時還會對一種以前他們不過敏的食物產生過敏，比如：科學家將玉米的某一段基因加入到核桃、小麥和貝類動物的基因中，蛋白質也隨基因加了進去，那么，以前吃玉米過敏的人就可能對這些核桃、小麥和貝類食品過敏。
第三是營養問題。科學家們認為外來基因會以一種人們目前還不甚了解的方式破壞食物中的營養成分。
第四是對抗生素的抵抗作用。當科學家把一個外來基因加入到植物或細菌中去，這個基因會與別的基因連接在一起。人們在服用了這種改良食物后，食物會在人體內將抗藥性基因傳給致病的細菌，使人體產生抗藥性。
第五是對環境的威脅。在許多基因改良品種中包含有從桿菌中提取出來的細菌基因，這種基因會產生一種對昆蟲和害蟲有毒的蛋白質。在一次實驗室研究中，一種蝴蝶的幼蟲在吃了含桿菌基因的馬利筋屬植物的花粉之后，產生了死亡或不正常發育的現象，這引起了生態學家們的另一種擔心，那些不在改良范圍之內的其它物種有可能成為改良物種的受害者。
如果知道某一基因的功能及其相應的蛋白質的氨基酸序列組成，可以通過何種方法克隆該基因?
答：可以通過合成核苷酸探針或設計簡并PCR引物從cDNA文庫或基因組文庫中篩選。或者利用相應的抗體從cDNA表達文庫中篩選相應的克隆。
列舉質粒載體必須具備的4個基本特性。
答： (1)獨立復制； (2)有選擇標記； (3)有獨特的酶切位點； (4)能轉化但不擴散。 3、PCR的基本原理是什么？用PCR擴增某一基因，必須預先得到什么樣的信息？
答：)DNA半保留復制的原理，在體外進行DNA的變性、復性和引物延伸。 (2)至少要預先知道足夠合成一對引物的靶DNA序列。
什么是基因組文庫(genomic library)?構建基因組文庫，涉及哪些基本過程?它同遺傳學上的基因庫有什么不同?
答：基因組文庫是用基因工程的方法，人工構建的含有某一生物基因組DNA的各種片段 的克隆群。一般以改造的噬菌體DNA或黏粒作為載體，包括下列過程：(1)高分子量染色體DNA的制備；(2)體外重組連接；(3)包裝蛋白的制備；(4)重組體的體外包裝；(5)將重組DNA導人寄主細胞；(6)篩選。基因組文庫同遺傳學上所講的基因庫是完全不同的概念。基因庫(gene pool)是指在進行有性生殖的某一群體中，能進行生殖的個體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構建中，由于使用的載體不同，分為噬菌體載體和黏粒載體構建的基因組文庫、YAC文庫、BAC文庫等。
常用的工具酶有哪些？其主要用途是什么？
答：限制性內切核酸酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA連接酶,堿性磷酸酶,末端脫氧核苷酸轉移酶. 限制性內切核酸酶, 能夠識別特異的DNA堿基序列， DNA堿基序列往往呈回文對稱結構； DNA 聚合酶 a 位于細胞核內，也許是復合物，有催化細胞增生的作用； Klenow大片段它也可以通過基因工程得到，分子量為 76kDa 。 DNA連接酶負責雙鏈DNA中相鄰3`-OH與5`-磷酸基團之間的磷酸二酯鍵的形成。 堿性磷酸酯酶的作用是從DNA或RNA的三磷酸核苷酸上除去5`磷酸根殘基。 末端轉移酶的作用是將脫氧核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵加到DNA分子的3`-OH末端。
常用的目的基因與載體的連接方法有哪些？
答：外源DNA片段同載體分子連接的方法，即DNA分子體外重組技術，主要是依賴于核酸內切限制酶和DNA連接酶的作用．一般說來在選擇外源DNA同載體分子連接反應程序時，需要考慮到下列三個因素： （1）實驗步驟要盡可能地簡單易行； （2）連接形成的"接點”序列，應能被一定的核酸內切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段； （3）對轉錄和轉譯過程中密碼結構的閱讀不發生干擾
基因工程論文(13)
基因工程實驗論文
——擬南芥PKS5基因在大腸桿菌中的表達
學 院 生命科學與化學學院
姓 名 沈 寧 燕
專 業 生 物 技 術
學 號 282020132
指導教師 馬 偉 超
擬南芥PKS5蛋白激酶在大腸桿菌中的克隆表達
（天水師范學院生化學院 甘肅 天水 741000）
摘 要：用puc19和pGEX-6p-1質粒構建重組子，將擬南芥基因轉入大腸桿菌進行表達。實驗過程中涉及到關于PCR，DNA凝膠電泳，限制性酶切，重組子的構建，以及重組子的篩選，目的基因的表達等等許多過程。
關鍵詞： PCR技術 重組子 DNA凝膠電泳
1前言
擬南芥（Arabidopsis thaliana）是一種十字花科（Cruciferae）的小型野草，早在16世紀被發現，19世紀末，科學家就注意到了它的研究價值。它是國際上第一個完成全部基因組序列測定的高等植物，其研究成果對于其他高等植物包括農作物的研究，將產生重大的影響，因此擬南芥的研究越來越受到國際植物學界及各國政府的重視。擬南芥作為一種模式植物，具有其他植物無法替代的優點：（1）生長周期短，從萌發到種子成熟僅6周；（2）基因組小，125Mbp，約25900個人基因；（3）基因組僅有5條染色體，1.3億個堿基對，其染色體數量是玉米的1/20；（4）具有雙子葉植物的所有特性，整個生命周期同樣經過細胞的分裂、生長發育、分化、衰老、死亡等一系列生物學現象；（5）有效的農桿菌介導轉化途徑，易獲得大量的突變體和基因組資源；（6）在有限的空間內科大量種植，收獲大量的種子。
基因工程學已成為生命科學的基礎學科之一，其基本理論和實驗技術已滲透到生物學的各個領域并促進了一批新學科的興起和發展。目前，以基因工程學位基礎的基因克隆重組技術已成為現代生物技術的核心。
本實驗通過對目的基因的提取，然后進行PCR擴增并進行凝膠電泳，篩選出帶有目的基因的質粒進限制性酶切，用puc19和pGEX-6p-1質粒構建重組子，將其轉入大腸桿菌，使擬南芥PKS5蛋白激酶得以在大腸桿菌細胞內表達。
2 試劑和器具
2.1菌株
含質粒的大腸桿菌、大腸桿菌（DH5ɑ，BL21）
2.2 試劑
50mmol/L葡萄糖，TrisHCl，EDTA，NaOH，SDS，KAc緩沖液，TE，RNaseA，模版DNA，PCR引物，Taq酶（5U/ul），10×緩沖液，MgCl（25mmol/L），dNTP，雙蒸水，DNAmarker，溴化乙錠，loadingbuffer，溴酚藍，質粒(PUC19和 pGEX-6p-1)，限制性內切酶及10×緩沖液，SanPrep柱式NDA凝膠回收試劑盒，T4連接酶及10×緩沖液，5%X-gal，25mg/mlIPTG,LB培養基，Amp培養基，Amp抗生素，氯霉素（25mg/ml），四環素（10mg/ml），Protein MW Marker，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，過硫酸銨，TEMED
2.3 器材
恒溫水浴鍋，分光光度計，超凈臺，移液器，臺式離心機，恒溫震蕩搖床，漩渦振蕩器，PCR擴增儀，凝膠電泳系統，Eppendorf管，紫外燈，冰箱，凝膠成像系統，PH計，電子天平，低溫離心機。
3 原理
3.1質粒的提取
質粒是一種染色體外的穩定遺產因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈閉環的DNA分子，并以超螺旋狀態存在于宿主細胞中。我們用堿裂解的方法來制備質粒DNA.
3.2 PCR擴增
PCR擴增是由變性、退火、和延伸3個步驟反復循環實現的。其中每一步的溫度、時間以及循環次數等參數都是非常重要的。DNA擴增結束后進行DNA凝膠電泳。電泳是帶電物質在電場中向著與其相反的電極移動的現象。各種生物大分子在一定的PH值條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。在DNA操作中常用的凝膠有兩種：（1）瓊脂糖凝膠電泳（2）聚丙烯酰胺凝膠
本次試驗擴增的是擬南芥蛋白激酶PKS5基因，基因大小為1.3kb。PKS5 編碼435個氨基酸。
3.3 限制性酶切及表達載體的構建
限制性內切酶是一種能夠識別和切割DNA雙鏈內特殊的核苷酸序列。限制性內切酶都有最適的反應溫度和緩沖液的濃度，其中溫度的要求是最嚴格的，一般是37℃，但也有30℃條件下比37℃稍好的。限制性內切酶的反應需要有Mg離子做輔助因子，濃度一般是5mmol/L，PH為7.2-7.6.酶切之后進行凝膠電泳，然后回收片段。
表達載體構建時要注意在原核細胞中的高效表達載體，這些載體通常具有以下幾個特點：（1）有一個強的原核啟動子及兩側的調控序列；（2）位于讀碼框上游的SD序列與起始密碼子之間有合適的距離；（3）在外源基因和啟動子之間有正確的閱讀框架；外源基因下游應加入不依賴P因子的轉錄終止區。
3.4 大腸桿菌轉化態細胞的制備以及重組質粒的轉化
所謂感受態，即指受體細胞最容易接受外源基因并實現轉化的一種生理狀態，它是由受體菌的遺傳決定的，同時也受菌齡，外界環境因子等影響。
3.5 外源基因的誘導表達及SDS-PAGE
外源基因在原核生物中的高效表達除了有適宜的載體外，還必須有適合的宿主細胞及誘導因子。宿主細胞的選擇隊外援基因的表達是至關重要的，因為外源基因在細菌中的表達往往不穩定，常常被水解。
外源基因的表達常采用化學誘導和溫度誘導兩種方法
4 操作方法
4.1基本流程：
細菌基因組DNA制備——→質粒DNA的提取——→對DNA PCR 擴增、瓊脂糖凝膠電泳——→限制性內切酶消化DNA及表達載體的構建——→感受態細胞的制備、重組質粒的轉化——→外源基因的誘導表達、SDS-PAGE
4.2基本步驟
4.2.1細胞基因組DNA制備
取1ml大腸桿菌，5000rpm，2min離心，棄上清，重復一次。沉淀中加入TE緩沖液，充分懸浮。加10%的SDS和蛋白酶k，37%溫育10min。加Nacl，混勻。加CTAB/Nacl，溫育10min。加氯仿/異戊醇，混勻，離心，取上清，加酚/氯仿/異戊醇后，取上清。加異戊醇，棄上清。加乙醇，棄上清。沉淀在室溫干燥，溶解于TE中保存。
4.2.2 質粒DNA的提取
取培養物離心2min，棄上清，重復一次分別加溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ以及相關的操作結束后，4 ℃8000rpm離心后取上清液，然后加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），混勻，12000rpm離心。取上層后加入等體積的異丙醇離心棄上清，用70%的乙醇漂洗后干燥，并加入RNaseA，37℃保溫
4.2.3 PCR基因擴增及瓊脂糖凝膠電泳
分別加入PCR擴增所需的試劑，稍作離心加入石蠟油，然后設定好程序進行PCR,PCR結束后加入200ulTE緩沖液，300ul苯酚/氯仿/異戊醇120000rpm離心，取上清加10%體積的NaAc和2.5倍的冰冷無水乙醇，-20℃冰箱中放置30min。4℃12000rpm離心，棄去上清，加1ml冰冷的70%乙醇再離心一次，棄去上清液后干燥，30ulTE緩沖液溶解沉淀，然后進行凝膠電泳確認，回收PCR產物，備用。
4.2.4 限制性內切酶消化及表達載體的構建
將PCR產物和質粒分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，然后將酶切質粒，PCR產物，10×PCR Buffer和DNA連接酶加入PCR管中，然后在16℃條件下保溫過夜，零下80℃保存備用。
4.2.5 大腸桿菌感受態細胞的制備與重組質粒的轉化
取大腸桿菌培養液2ml至Eppendorf管中，冰浴使其停止生長，4℃離心，棄去上清液。用0.5mol/L的MgCl2溶解沉淀，在離心一次，棄去上清液，再用0.5ml冰冷的含20%甘油的0.1mol/LCaCl2溶解沉淀，冰浴30min，4℃離心棄上清，沉淀用100ul冰冷的含20%甘油的0.1mol/LCaCl2+溶解，冰浴，備用。
將重組質粒加入感受態細胞中，冰置30min然后42℃水浴2min，然后分別加入SOC培養液使其正常生長，將菌液搖勻后涂布到Amp培養基上。37℃培養16-24h，觀察結果。
4.2.6 外源基因的誘導表達及SDS-PAGE
將導入重組子的BL21菌落接種于2ml含有Amp和氯霉素的LB培養基中，取培養液100ul于5ml含Amp的LB培養基上培養2-3h，然后加入四環素培養，取1ml樣品作為IPTG誘導前的樣品，-20℃保存。將誘導前的樣品和誘導后的樣品分別離心，回收沉淀，將沉淀用緩沖液和雙蒸水溶解并在沸水浴中10min立即放入冰浴中冷卻。12000rpm離心2min，回收上清液，然后取10ul的誘導前的對照樣品與5ul的誘導后的樣品以及5ul的Protein MW Marker上樣，進行SDS-PAGE分析。電泳結束后拍照、分析。
5 結果分析
4.2.1中測得A280為0.072，A260為0.170。A280/A260為2.3，說明提取到的DNA含有雜質。雜質可能為蛋白質或者RNA。
4.2.2中測得A280為0.013，A260為0.024。A280/A260為1.85，目前說明比較純凈，要證明是否純凈，還需進一步電泳才能肯定。
4.2.3電泳條帶如下圖
由電泳圖譜可知：1.質粒DNA有合適的條帶，但含量較少。2.PCR擴增，有合適的條帶，但含量較少。
4.2.4電泳條帶如下圖
由電泳圖譜可知：體外連接的DNA片段少，可能由于PCR產物少，并且操作過程中試劑沒有完全保證在冰浴。
4.2.5培養24h后，觀察到培養基上未長出菌落。可能由于操作不夠輕柔造成。
4.2.6電泳條帶如下圖
由電泳圖譜可知：在重組子的構建連接重組子的圖譜，在圖譜上有清晰的條帶，說明重組子構建很成功；右圖為PKS5蛋白的電泳圖譜。在66.4左右的地方有清晰的條帶，說明PKS5蛋白在大腸桿菌中表達了。
6 參考書目
基因工程綜合性實驗講義
基因工程原理教材
