有關基因工程的論文17篇
有關基因工程的論文(1)
基因工程的運輸車載體
摘要：基因工程已經成為生物科學中不可或缺的一部分.也是最令人類充滿無限遐想的一門科學.自從解開人類基因組后,長生不老等就古老的傳說又再度流行起來.盡管現在的基因技術還不能做到讓你真的長生不老,但是基因療法等技術的出現已經讓人們看到了基因工程的生命力。基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其它載體分子，構成遺傳物質的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的寄主細胞內，而能持續穩定地繁殖。基因載體是作為基因導入細胞的工具。猶如火箭能把衛星射向九天一樣，基因載體可以把目的基因送入靶細胞內，從而發揮目的基因的特定功能。
關鍵詞：基因、載體、運載、自主復制、表達
正文：
一、質粒載體
植物基因工程是近代迅速發展起來的新興生物技術,它的目的旨在通過導入有用的外源基因，獲得轉基因植物，以用于物種的改良。它的出現為農業生產提供了前所未有的機遇和挑戰,尤其是在作物的抗病、抗蟲、抗除草劑、抗逆及品種改良等方面提供了更為廣闊的應用前景。其中作為基因工程的載體更是基因工程中的不可或缺的一個部分，它是基因工程的核心部分，沒有合適的載體，就不能得到合適的結果。
載體是指運載外源DNA有效的進入受體細胞內的工具。載體同外源DNA在體外重組成DNA重組分子，在進入受體后形成一個復制子，即形成在細胞內能獨自進行自我復制的遺傳因子。
基因載體是把基因導入細胞的工具，他的作用是一是運載目的基因進入宿主細胞，二是使之能得到復制和進行表達。按照不同的情況下的作用可以分為不同情況的載體，根據來源：質粒載體、噬菌體載體、病毒載體；根據用途：克隆載體、表達載體；根據性質：溫度敏感型載體，融合型表達載體、非融合型表達載體。
作為載體必須滿足的條件：有多種限制性內切酶的切點，但每一種酶最好只有一個切點；外源DNA插入以后載體在受體細胞中自我復制；有便于選擇的標記基因；具有促進外源DNA表達的調控區。其中質粒載體是應用較早的一種工程載體。
質粒是在許多種細菌中發現的染色體外的遺傳因子。它是閉合環狀雙鏈DNA分子，大小1kb到200kb不等。能自主復制，但要利用寄主細胞復制染色體的同一組酶系。有某些基因，如抗藥性基因，對寄主的生長是有利的。質粒的復制分松弛型和嚴謹型兩種。松弛型質粒是指質粒的復制跟細菌染色體的復制不同步，一般在一個菌體內能復制10-200 拷貝；嚴謹型質粒是指質粒復制跟細菌染色體同步，一般含有1-10 拷貝。
質粒的復制，通常一個質粒含有一個與相應的順式作用控制要素結合在一起的復制起始區。在不同的質粒中，復制起始區的組成方式是不同的，有的可決定復制的方式，如在大腸桿菌中使用的大多數載體都帶有一個來源于 pMB1 質粒或 ColE1 質粒的復制起始位點。質粒的拷貝數，質粒拷貝數分為嚴謹型與松馳型。嚴謹型質粒每個細胞中拷貝數有限，大約 1 ～幾個；松馳型質粒拷貝數較多，可達幾百。質粒的不相容性，兩個質粒在同一宿主中不能共存的現象稱質粒的不相容性，它是指在第二個質粒導入后，在不涉及 DNA 限制系統時出現的現象。不相容的質粒一般都利用同一復制系統，從而導致不能共存于同一宿主中。兩個不相容性質粒在同一個細胞中復制時，在分配到子細胞的過程中會競爭，隨機挑選，微小的差異最終被放大，從而導致在子細胞中只含有其中一種質粒。轉移性，質粒具轉移性。它是指在自然條件下，很多質粒可以通過稱為細菌接合的作用轉移到新宿主內。它需要移動基因，轉移基因，順式因子， 及其內部的轉移缺口位點。
二、λ 噬菌體載體
噬菌體是感染大腸桿菌的溶源性噬菌體，在感染宿主后可進入溶源狀態，也可進入裂解循環。 l 噬菌體基因組為長度約為 50kb 的雙鏈 DNA 分子，實際大小為 48502bp （GenBank 注冊號為：J02459 或 M17233）。在噬菌體顆粒內，基因組 DNA 呈線性，其兩端的 5" 末端帶有 12 個堿基的互補單鏈粘性末端，叫COS位點。 12 個堿基的序列為 5"-GGGCGGCGACCT-3"。當 l 噬菌體 DNA 進入宿主細胞后，COS位點兩端互補單鏈通過堿基配對形成環狀 DNA 分子，而后在宿主細胞的 DNA 連接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封閉的環狀 DNA 分子，充當轉錄的模板。同時COS位點也是噬菌體包裝蛋白的識別位點，包裝范圍在35kb－51kb。
噬菌體的基因組可分為3個區域：右側的DNA復制與調控及裂解相關區域，左側是頭部蛋白和尾部蛋白基因區域，中間為非必需區，可被外源基因取代。野生型 λ 噬菌體基因組 DNA 為 48kb ，若用外源 DNA 片段完全替換可取代區，外源 DNA 片段的大小將在 9-23kb 范圍內。λ噬菌體的選擇標記：lacZ 基因
lacZ 基因也可用于 λ 噬菌體載體，通過插入或替換載體中的 β-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通過噬菌斑的顏色，篩選重組噬菌體。噬菌體λ載體有兩種類型：插入型和置換型。插入型λ噬菌體是由于改建后的噬菌體λ較野生型短，所以可插入外源DNA。而且缺失的片段越長，插入的片段越大。置換型λ噬菌體基因組分三個區域：左側區域包括外殼蛋白基因，約20kb；中間區域18kb，為不重要的替換區，可被外源基因替換；右側區域含有復制及裂解基因，約12kb。λDNA與外源DNA之和必須在39-53kb之間，所以可插入7-21kb的外源DNA片段。
三、柯斯質粒載體：
1978年由Collins和 Hohn改建的一種新型的大腸桿菌克隆載體，用正常的質粒與噬菌體λ的cos位點構成。一般長為4-6kb。含有Ampr和Tetr 抗性基因。其上的cos位點可識別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點的任何DNA分子只要在長度上相當于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結合而被包裝成類似噬菌體λ的顆粒。因此，插入柯斯質粒的外源DNA片段的長度可大于40 kb，從而大大增加了載體的攜帶能力。
粘粒的結構特征和用途：粘粒（cosmid）實際是質粒的衍生物，是帶有 cos 序列的質粒。粘粒的組成包括質粒復制起點（colE1），抗性標記（ampr）， cos 位點，因而能象質粒一樣轉化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用來克隆大片段 DNA ，克隆的最大 DNA 片段可達 45kb 。
粘粒載體的工作原理 ：粘粒克隆的主要原理類似 l 噬菌體載體。在外源片段與載體連接時，粘粒載體相當于 l 噬菌體載體的左右臂， cos 位點通過粘端退火后，再與外源片段相間連接成多聯體。當多聯體與 l 噬菌體包裝蛋白混合時， l 噬菌體 A 基因蛋白的末端酶功能將切割兩個 cos 位點，并將兩個同方向 cos 位點之間的片段包裝到 l 噬菌體顆粒中去。這些噬菌體顆粒感染大腸桿菌時，線狀的重組 DNA 就象 l 噬菌體 DNA 一樣被注入細胞并通過 cos 位點環化，這樣形成的環化分子含有完整的粘粒載體，可象質粒一樣復制并使其宿主獲得抗藥性。因而，帶有重組粘粒的細菌可用含適當抗生素的培養基挑選。通過這種方式，就將外源 DNA 片段通過粘粒載體克隆到大腸桿菌中了。與 l 噬菌體載體不同的是，外源片段克隆在粘粒載體中是以大腸桿菌菌落的形式表現出來的，而不是噬菌斑。這樣所得到的菌落的總和就構成了基因文庫。
四、克隆載體
克隆載體主要用于擴增或保存 DNA 片段，是最簡單的載體。
1．pBR322
pBR322 質粒的大小為 4361bp ， GenBank 注冊號為 V0lll9 和 J01749 ，含有 30 多個單一位點，具有四環素抗性基因（tetr）和氨芐青霉素抗性基因（ampr），其質粒復制區來自 pMB1。目前使用廣泛的多質粒載體幾乎都是由此發展而來的。利用四環素抗性基因內部的 BamHⅠ 位點來插入外源 DNA 片段，可通過插入失活進行篩選。
2．pUC18 和 pUC19
pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的質粒載體，其結構組成緊湊，幾乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注冊號為 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而來，其中 lacZ （MSC）來自 M13mp18/19。
這兩個質粒的結構幾乎是完全一樣 的，只是多克隆位點的排列方向相反。這些質粒缺乏控制拷貝數的 rop 基因，因此其拷貝數達 500-700 。 pUC 系列載體含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分編碼序列，在特定的受體細胞中可表現 α-互補作用。因此在多克隆位點中插入了外源片段后，可通過 α-互補作用形成的藍色和白色菌落篩選重組質粒。
除了上面所說的載體，常用的載體還有穿梭載體，穿梭載體是指具有多個復制子能在兩個以上的不同宿主細胞復制和繁殖的載體。表達載體，表達載體是指能將目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生產的載體。表達載體的三個系統:DNA復制及質粒DNA的篩選: 有DNA復制起點ori, 及Amp, Tet抗性基因 ；目的基因的轉錄:這一系統包括啟動子,抑制物基因和轉錄終止子.啟動子位于目的基因的上游,常用的如Placz等；蛋白質的翻譯:包括核糖體識別位點SD,翻譯起始密碼子和終止密碼子。表達載體又分為完整蛋白表達載體和融合蛋白表達載體兩類。該類載體是在常規克隆載體的基礎上衍生而來的，主要增添了強啟動子，以及有利于表達產物分泌、分離或純化的元件。
五、載體的應用，抗逆性
根據植物抵抗逆境(如抗旱、抗熱、抗寒、耐鹽堿、耐貧瘠等) 的生理反應,可以將自然界中多種適應性基因發掘出來,如將大豆的抗熱性基因分離并轉移到煙草中,并獲得了成功。胡蘿卜抗凍蛋白(AFPs) 及其基因的發現,為植物抗寒基因工程注入了新的活力。1999年,Meyer 等[17 ]用農桿菌介導胡蘿卜AFP 基因重組子轉化擬南芥,誘導了一系列低溫調節蛋白的表達,使未經低溫馴化的植株具有較強的抗寒能力。美國斯坦福大學把仙人掌基因導入小麥、大豆等作物,育成抗旱、抗瘠的新品種。我國在抗逆基因的分離、克隆和轉化等方面的研究也有新進展,克隆的耐鹽堿相關基因已在煙草、水稻、玉米和八里莊楊等植物中進行了遺傳轉化,獲得了耐2 %氯化鈉的煙草、耐0. 6 %氯化鈉的木本植物八里莊楊、耐1. 17 %氯化鈉的玉米及耐鹽能力達到0. 5 %氯化鈉的水稻[18 ] [19 ] 。2001 年,尹明安等[20 ]根據克隆的胡蘿卜AFP 基因,構建成植物表達載體pBAF ,為農桿菌介導轉化番茄、甜椒等作物奠定了實驗基礎。相信在不久的將來,會有各種具有強烈抗逆特性的轉基因植物出現,使它們在逆境中能更好地生存。
參考文獻：程業明,王玉民等. 植物基因工程在農業生產中的應用. 吉林農業科學。
解謙. 植物基因工程在農業上的應用[J].大同職業技術學院學報,2004.
百度文庫，百度百科
有關基因工程的論文(2)
溶菌酶的工程改造及其應用
學號：11300323 姓名：周成林 班級：11級03班
摘要：溶菌酶普遍存在于動物、植物和微生物中。溶菌酶是一種小分子堿性蛋白, 長期以來一直被作為一種“模型”體系, 用于研究蛋白質的空間構象、酶動力學及其與分子進化、分子免疫間的關系。介紹了溶菌酶的來源、結構、性質、作用機制。并對近年來其在食品工業、醫學和酶工程中的應用進行了綜述; 分析了溶菌酶應用中存在的主要問題, 并對其應用前景進行了展望。
關鍵詞：溶菌酶、工程改造、應用
溶菌酶( lysozyme) 是一種專門作用于微生物細胞壁的水解酶, 又稱胞壁質酶( muram-i dase) 。人們對溶菌酶的研究始于上世紀初, 英國細菌學家Fleming在發現青霉素的前6 年( 1922 年) 發現人的唾液、眼淚中存在有溶解細菌細胞壁的酶, 因其具有溶菌作用, 故命名為溶菌酶。溶菌酶可選擇性地分解微生物細胞壁的同時不破壞其它組織, 且本身無毒無害, 因而它是一種天然的安全性能很好的殺菌劑、防腐劑, 將可廣泛應用于食品防腐、醫藥制劑、日用化工等行業。在我國, 溶菌酶的應用范圍和應用量還比較有限,因此溶菌酶的功能特性需要一些改善，其中主要是抗菌范圍的擴大和熱穩定性的提高。
一、溶菌酶的結構與性質
在過去很長一段時間中, 溶菌酶一直被當作一種研究蛋白質空間構象、酶動力學及分子進化的理想模型。其中有許多蛋白晶體研究及蛋白質結構與功能關系研究進展都是利用溶菌酶獲得的[ 1]。溶菌酶是一種葡萄糖苷酶, 其化學性質穩定, 干燥條件下在室溫可長期保存, 其純品為白色或微黃色結晶體或無定型粉末, 無嗅, 味甜, 易溶于水, 不溶于丙酮、乙醚。其中雞蛋清溶菌酶是研究最清楚的一種溶菌酶，它由18種129 個氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質， 在分子中的4對含硫氨基酸Cys 間形成4個S-S 鍵。Phillips 等人1965 年用x 射線晶體結構分析法闡明了溶菌酶的三維結構, 溶菌酶分子近橢圓形, 大小為4.5 nm×3.0 nm×3.0 nm, 其構象復雜, α螺旋僅占25%,在分子的一些區域有伸展著的β片層結構, 研究表明溶菌酶的內部幾乎都為非極性的, 疏水的相互作用在溶菌酶的折疊構象中起到重要作用, 其分子表面有一個容納多糖底物6 個單糖的裂隙, 這是溶菌酶的活性部位【2】
二、溶菌酶的功能
2．1溶菌酶的抑菌作用
溶菌酶具有廣泛的抑菌譜。蛋清溶菌酶能分解溶壁微球菌、巨大芽孢桿菌、黃色八疊球菌等許多革蘭氏陽性菌。不同來源的溶菌酶的抑菌譜不同。楊向科等通過實驗研究表明， 海洋微生物溶菌酶對多種雞蛋蛋清溶菌酶不能直接作用的微生物如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌等都有溶菌作用； 并且海洋微生物溶菌酶對一些革蘭氏陰性菌也具有明顯的抑制作用［3］。W.H.Holzapfel等推測革蘭氏陰性菌可能擁有一層外膜能保護細胞免遭蛋清溶菌酶作用， 這層膜可以被螯合劑EDTA 破壞從而使細菌對溶菌酶敏感；Morrison 等認為革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜上的脂多糖對蛋清溶菌酶有很強的親和性，從而阻止溶菌酶的滲透， 使蛋清溶菌酶不能分解革蘭氏陰性菌。不同來源的溶菌酶的酶學性質也有很大差別，人溶菌活性比雞蛋溶菌酶高3 倍， 而植物溶菌活性比雞蛋溶菌酶低。微生物產生的溶菌酶通常是幾種相關酶的混合物，由于彼此間的協同作用使其對細菌細胞壁的溶解能力增強［4］。在溶菌酶上連接疏水基團能明顯擴大其抑菌譜，增強對革蘭氏陰性菌的抑制作用，并隨配基疏水能力的增強而增強，但對革蘭氏陽性菌的抑制作用減弱［5］。
溶菌酶還具有抗炎消腫和增強免疫力的作用。肽聚糖是細菌細胞壁的重要組成成分, 溶菌酶可水解肽聚糖中N- 乙酰胞壁酸( NAM)和N- 乙酰葡萄糖胺( NAG) 中的B- 1, 4 糖苷鍵, 在滲透壓作用下導致革蘭陽性菌細胞壁破裂, 發生溶菌作用[ 6]. 溶菌酶水解細胞壁時所釋放的肽聚糖碎片是合成與分泌各種抗菌蛋白包括溶菌酶的誘導物，溶菌酶可清除其它抗菌因子作用后所殘余的細菌細胞壁并增強其它免疫因子的抗菌敏感性， 協同抵制外來病原的入侵[7]。溶菌酶是嬰兒生長發育必需的抗菌蛋白，對殺死腸道腐敗球菌有特殊作用。小兒急性鼻竇炎是一種與病毒、細菌感染、免疫功能異常及遺傳因素等有密切關系的疾病。柴向華等通過向小兒急性鼻竇炎患者處方藥中添加溶菌酶來研究溶菌酶的功效時發現， 服用溶菌酶的患兒的治愈時間明顯短于未服溶菌酶的患兒，證明溶菌酶能明顯增強機體免疫力[8]。
2.2溶菌酶的抑菌機制
目前已知的幾種溶菌酶有: 內- N - 乙酰己糖胺酶、酰胺酶、β- 1, 3、β- 1, 6葡聚糖酶和甘露聚糖酶、幾丁質酶、磷酸甘露糖酶、脫乙酰
殼多糖酶[ 9] 。參與細菌細胞壁溶解作用的溶菌酶大致可分為作用于糖苷鍵和作用于肽和酰胺部分的兩類。內- N - 乙酰己糖胺酶、β- 1, 3、β-1, 6葡聚糖酶等主要作用于糖苷鍵, 使糖苷鍵斷裂, 破壞細胞壁的分子結構, 而酰胺酶等則主要作用于多肽, 使多肽斷裂。以內- N - 乙酰己糖胺酶為例, 內- N - 乙酰己糖胺酶能夠催化水解細胞壁肽聚糖分子中的N - 乙酰胞壁酸( NAM )與N - 乙酰葡萄糖氨( NAG) 之間的β- 1, 4糖苷鍵, 使肽聚糖分子發生斷裂, 使細胞壁內外兩側滲透壓失衡, 造成細胞破裂, 導致微生物因細胞壁溶解而被殺死[ 10] 。溶菌酶對革蘭氏陽性菌(G+ ) 細胞與革蘭氏陰性菌( G- ) 的溶菌作用,由于兩者細胞壁中肽聚糖含量不同而存在差異,G+ 細胞壁含80%肽聚糖, 而G- 細胞壁只有在內壁層含有少量肽聚糖, 因此, 溶菌酶能有效殺死G+ 菌, 而對G- 細胞破壞很小。
三、溶菌酶的工程改造
溶菌酶是一種比較穩定的蛋白質, 通過下列措施可以進一步改善溶菌酶的功能特性。3.1抗菌范圍的擴大
溶菌酶能快速有效的催化細菌細胞壁中肽聚糖的水解，因而被廣泛用于消炎藥中，但溶菌酶只對革蘭氏陽性菌有抗菌作用，而對絕大多數的革蘭氏陰性菌不顯示抗菌效果。因為革蘭氏陰性菌的細胞外膜能阻礙溶菌酶接觸其底物肽聚糖。采用有效的手段提高溶菌酶突破外膜障礙接觸肽聚糖，則有可能把溶菌酶的抗菌范圍擴大到革蘭氏陰性菌。
Kato等證實在溶菌酶的C端融合疏水性短肽片段或在多肽鏈的側鏈上引進糖基可有效擴大溶菌酶的抗菌能力【11】
3.2熱穩定性的提高
3.2.1六環水可以提高溶菌酶的熱穩定性
趙林等的研究表明[12], 水經低溫超聲定頻譜振后, 大多數呈六環和六籠形水分子簇存在。這種水在生物蛋白、核酸、細胞與組織活動中起到重要作用。經DSC法實驗證明, 用六環水合溶菌酶時, 每個溶菌酶分子周圍的結合水分子數較普通水的分子數258 個增加了150 個, 達到408 個, 相當于溶菌酶中每個極性氨基酸殘基對應約6 個水分子, 這些水分子在溶菌酶分子周圍往往形成六籠形的動態氫鍵網絡, 這種六籠形機構具有最為穩定的結構能。結構水物化特性的改變有助于溶菌酶中疏水相互作用力的加強, 溶菌酶周圍有序的結合水量和水化層強度增加, 從而加強了維持溶菌酶等蛋白質三維結構的作用力, 因此增加了溶菌酶的穩定性。
3.2.2定點突變改變溶菌酶的穩定性
Song 等[13] 在雞蛋清溶菌酶淀粉樣蛋白產生突變體I55T 和D66H的基礎上, 應用定點突變構建了具有在49 位用門冬酰胺替代甘氨酸的N- 糖基化信號序列(Asn- X- Ser) 的糖基化淀粉樣蛋白生產突變體( I55TPG49N, D66HPG49N) , 這些糖基化突變體比非糖基化突變體在酵母表達系統S . cerevisiae 的分泌大大增加, 糖基化突變體在37 e 、pH7. 4 條件下, 仍保持40% 的酶活性, 而非糖基化突變體在同樣條件下最后失去全部活性, 說明糖基化鏈能掩蔽淀粉樣蛋白生產的溶菌酶分子的B- 折疊, 增加了淀粉樣蛋白生產的溶菌酶的穩定性。
四、溶菌酶的應用
4.1溶菌酶在食品工業中的應用
溶菌酶對牛奶中革蘭氏陽性菌、好氣性孢子形成菌、枯草桿菌、地衣型芽孢桿菌等作用非常強。由于溶菌酶具有一定的耐高溫性能，也適用于超高溫瞬間殺菌奶， 其方法為在包裝前添加或在殺菌前添加。每噸牛奶加入0.05～0.1mg 溶菌酶，37℃保溫3h，可使牛奶中雙歧桿菌的含量與人奶無顯著差別， 從而保證嬰兒腸道內雙歧桿菌的良好增殖。在半硬干酪中加入0.001%的溶菌酶，可防止香味物質丁酸的損失，同時能阻止由于厭氧孢子增殖體（如酪梭桿菌）的作用所引起的脹氣等[14]。張德權等選取Nisin、溶菌酶、乳酸鈉、茶多酚、殼聚糖等5 種天然保鮮劑對冷卻羊肉進行保鮮處理， 結果發現溶菌酶的保鮮效果優于乳酸鈉、茶多酚、殼聚糖[15]。在低度酒中添加溶菌酶不僅對酒的風味無任何不良影響, 還可防止產酸菌生長, 是低度酒良好的防腐劑。在日本清酒中大部分微生物不能生存, 但有一種叫做火落菌的乳酸菌則能生長, 并產酸使酒發臭, 添加溶菌酶后火落菌被有效抑制, 成功代替水楊酸作防腐劑用于清酒中[ 16] 。倪瑛等[ 17] 報道, 向葡萄酒中加入一定量的溶菌酶,可以大大減少SO2 的使用量, 減小了SO2 使用過多可能對人體造成的毒害作用。此外, 溶菌酶還可以添加到果汁中作為防腐劑使用。
4.2在醫療中的應用
溶菌酶對G+ 、枯草桿菌等有很好的殺滅作用, 對大腸桿菌、普通變球菌等G- 也具有一定程度溶解。此外,溶菌酶與抗菌素合用效果更佳, 因而, 溶菌酶廣泛應用于醫藥行業, 如利用溶菌酶治療各種五官科炎癥, 尤其對急性炎癥如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明顯[18]。戴清源等[19]報道, 正常情況下, 人體尿液中一般只存在少量溶菌酶, 因此測量尿中溶菌酶含量, 有助于檢測腎小管功能障礙性疾病。同時, 燒傷病人分泌的溶菌酶比常人多出幾倍, 也可在尿液中檢出, 有助于對手術移植排斥、燒傷嚴重程度的判斷。
4.3在畜禽飼料中的應用
溶菌酶對革蘭氏陽性菌、枯草桿菌、耐輻射微球菌有很強分解作用; 對大腸桿菌、普通變形菌和副溶血弧菌等革蘭氏陰性菌等也有一定的殺滅作用; 與聚合磷酸鹽和甘氨酸等配合使用, 具有良好的防腐作用。在飼料中添加溶菌酶可防止霉變,延長飼料的貯存期, 減少不必要損耗[ 20]。沈彥萍等[21]報道, 溶菌酶對防治仔豬腹瀉有顯著作用, 可達到抗生素的使用效果, 治愈率達80%以上。溶菌酶與免疫球蛋白的功能緊密聯系, 體內溶菌酶主要來自嗜中性白細胞、單核細胞及吞噬細胞溶酶體, 可進入機體補體系統并增強抗體活性, 從而殺滅有害微生物。
五、展望
由于溶菌酶具有天然、易消化、易吸收、無毒性、無殘留、無污染的特點, 因此, 可廣泛應用于食品添加劑、飼料防腐劑、醫療等方面。但是它也存在抗菌譜窄、提取造價高等問題, 所以如何開發出抗菌譜廣、穩定性高、價格低廉的產品, 是未來一段時間需要深入研究的問題。盡管我國對溶菌酶開發應用十分有限, 但隨著科學技術的不斷發展和人民生活水平的不斷提高, 人們對食品和醫藥的安全性要求會越來越高, 這勢必會促進科學工作者致力于進一步研發天然溶菌酶。
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有關基因工程的論文(3)
生物基因論文基因工程的論文：
腦源性神經生長因子基因體外轉染鼠雪旺細胞的生物活性
[摘要]目的探討應用重組腺病毒載體攜帶腦源性神經生長因子（BDNF）基因轉染雪旺細胞（SCs）的可行性及促進外周神經損傷恢復的有效途徑。方法采取6～7天SD乳鼠坐骨神經，利用酶消化法、差速貼壁法分離獲得雪旺細胞，阿糖胞苷與Geneticin聯合應用純化、BPE促進雪旺細胞增殖，獲取大量高純度的雪旺細胞。使用含BDNF基因的重組腺病毒（Ad-BDNF），經不同感染復數（MOI）病毒量感染體外培養的大鼠源性SCs。逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測感染后72 h的BDNF mRNA，ELISA定量分析感染后 3 d、6 d、9 d、12 d、15d、18 d和 21 d時感染后SCs培養液上清中BDNF的表達。
關鍵詞：雪旺細胞基因轉染腦源性神經生長因子
中圖分類號：R329.28 文獻標志碼：B 文章編號：1004-7484（2010）12-0029-03
腦源性神經生長因子（BDNF）是一種重要的神經營養因子，能夠促進創傷后神經的修復與再生和減少神經元的死亡[2]。本研究通過將攜帶有BDNF基因的重組腺病毒表達載體轉染體外培養的雪旺細胞，以檢測BDNF基因的調控表達情況。探索基因治療外周神經損傷的新途徑，為進一步臨床應用治療基因通過腺病毒載體轉染雪旺細胞促進周圍神經損傷修復奠定實驗基礎。
1材料與方法
1.1材料
倒置相差顯微鏡；光學顯微鏡；CO2孵箱；超凈工作臺；高速冷凍離心機；DUR530核酸蛋白分析儀；PCR儀；微型垂直平板電泳槽及電轉移系統；凝膠成像分析系統；酶標儀；DMEM培養液；山羊抗 S-100 多克隆抗體；兔抗 BDNF 多克隆抗體；HRP標記的兔抗山羊IgG抗體；HRP標記的山羊抗兔IgG抗體；DAB顯色劑；總RNA提取試劑盒；RT-PCR反應試劑盒；DNA Marker DL2000；硝酸纖維素膜；胎牛血清；胰蛋白酶；Ⅰ型膠原酶；阿糖胞苷；多聚賴氨酸；Geneticin；牛腦垂體提取物；SABC試劑盒；兔抗S-100單抗； ECL 試劑；鼠BDNF蛋白ELISA試劑盒。
有關基因工程的論文(4)
基因工程基本條件分析報告（載體）
一、基因工程載體的定義
在基因工程中，通常是把外源DNA片斷利用運載工具送入生物細胞。攜帶外源基因進入受體細胞的這種工具叫做載體(Vector)。
二、基因工程載體必須具備的基本條件
1. 具有對受體細胞的親緣性或親和性（可轉移性）
2. 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點
3. 長度盡可能小，以提高其載裝能力
4. 具有多種單一的酶切位點，容易插入外來核酸片段，插入后不影響其進入宿主細胞和在細胞中的復制。
5. 具有合適的選擇性標記，當其進入宿主細胞、或攜帶著外來的核酸序列進入宿主細胞都能容易被辨認和分離出來。
三、載體類型
載體的分類：
1.根據來源和性質分類：質粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、噬菌粒載體、病毒載體、人工染色體載體。
2.根據功能和用途分類：克隆載體、表達、測序、轉化、穿梭、多功能載體
四、常用主要載體分析
一、質粒載體
??? 質粒作為一種裸露的，比病毒更簡單的，有自主復制能力的DNA分子，是處于生命與非生命的分界線上。
(一) 質粒的一般生物學特性
質粒（plasmid)是染色體以外能自主復制的雙鏈閉合環狀DNA分子，它廣泛存在于細菌細胞中。在霉菌、藍藻、酵母和不少動植物細胞中也發現有質粒存在。目前對細菌質粒研究的較為深入，在基因工程中，多使用大腸桿菌質粒為載體。
?質粒分子的大小為1~200kb，質粒和病毒不同，它是裸露的DNA分子，沒有外殼蛋白，在基因組中，也沒有溶菌酶基因。質粒可以′友好”的“借居”在宿主細胞中，也只有在宿主細胞中，質粒才能完成自己的復制。同時將其編碼的一些非染色體控制的遺傳性狀進行表達，賦予宿主細胞各種有利的表型。
1．質粒的類型? ??
? 大腸桿菌中現已找到許多類型的質粒，其中對F質粒，R質粒和Col質粒研究的較為清楚。由于這些質粒的存在，寄主細胞獲得了各自不同的性狀特征。簡介如下：
?①F質粒：又叫F因子或性質粒(sex plasmid)。 F因子是雄性決定因子，所以F+細胞又叫雄性細胞，與此相應的F—細胞則叫做雌性細胞。F+細胞的表面可以形成一種叫做性須(pilus)的結構，它促進雄性細胞同雌性細胞進行配對。在合適的條件下，將雄性細胞和雌性細胞混合培養，由于性須的作用，就會形成雌—雄細胞配對。我們稱這種過程為細菌的接合作用(conjugation)。在雌雄細胞配對期間，雄性細胞中的F因子按滾環復制模式，經性須作用進入到雌性細胞。配對之后F—受體細胞獲得了F因子，也變成為F+細胞。
?②R質粒：也稱抗藥性因子。R質粒編碼一種或數種抗菌素抗性基因，此種抗性通常能轉移到缺乏該質粒的受體細胞，使后者也獲得同樣的抗菌素抗性能力
③Col質粒：此類質粒編碼有控制大腸桿菌素合成的基因，即所謂產生大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是一種毒性蛋白，它可以使不帶Col質粒的親緣關系密切的細菌菌株致死。
2．質粒的復制類型
??? 一種質粒在一個細胞中存在的數目，稱為質粒的拷貝數。根據宿主細胞所含拷貝數的多少，可把質粒分成兩種不同的復制型。一種是低拷貝數的質粒，稱“嚴緊型”復制控制的質粒(stringent plasmid)，此類質粒每個宿主細胞僅含1~3份的拷貝。另一類是高拷貝數的“松弛型”復制控制的質粒(relaxed plasmid)，這類質粒每個宿主細胞可達到10~60份拷貝。
??? 一種質粒究竟是屬于嚴緊型還是松弛型并不是絕對的，這往往同宿主的狀況有關。同一質粒在不同的宿主細胞中可能具有不同的復制型，這說明質粒的復制不僅受自身的制約，同時還受到宿主的控制。
??? 在一般情況下，質粒的接合轉移能力與復制型及分子大小間有一定的相關性。現歸納如下：
???????????????? 分子量大????????????????????????? 分子量小
??? 接合型質粒?? 拷貝數少?????? 非接合型質粒?????? 拷貝數多
???????????????? 嚴緊型復制??????? ????????????????松弛型復制
3．質粒的不親和性
??? 在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質粒，不能在同一宿主細胞中穩定地共存，這一現象稱為質粒的不親和性(plasmid incompatibility)，也稱不相容性。例如colEI派生質粒，它們之間是互不相容的，也就是說，這些親緣關系較近的不同質粒，當兩種進入同一細胞后，必定有一種在細胞的增殖過程中，被逐漸排斥(稀釋)掉。稱這些質粒間是不相容的。
??? 彼此不相容的質粒屬于同一個不親和群Gneompatiblity group)。而彼此能夠共存的親和質粒，則屬于不同的不親和群。大腸桿菌質粒現已鑒別出25個以上的不親和群。它們之間是相容的，而同一個不親和群內的質粒是不相容的。
(二) 作為質粒載體的基本條件
以上討論的都是天然質粒，天然質粒的研究在理論上和遺傳學等方面作出了貢獻，但它很難直接作為基因工程的運載體應用。質粒載體絕大多數是以天然質粒為基礎，人工改造和組建形成的實用載體。可根據不同的實驗要求，加以選擇。??
作為理想的質粒載體，應具備以下幾個條件：
(1) 能自主復制，即本身是復制子
(2) 具有一種或多種限制酶的單一切割位點，并在此位點中插入外源基因片段，不影響本身的復制功能；
(3) 在基因組中有1~2個篩選標記，為寄主細胞提供易于檢測的表型特征。
(4) 分子量要小，多拷貝，易于操作。
二、大腸桿菌質粒載體
?1．質粒pBR322質粒
質粒pBR322是經人工構建的一種較為理想的大腸桿菌質粒載體，亦是應用最為廣泛的克隆載體，利用pBR322曾克隆到多種基因，雖然現在已有多種具有更優良特性的新型克隆載體逐漸代替了pBR322在基因克隆中地位，但pBR322仍是人工構建的具有幾乎所有的理想特性的基因克隆載體之一。
（1）pBR322質粒的結構
從pBR322質粒的構建過程，可以知道它是由三個不同來源的部分組成的，
第一部分來源于pSF2124質粒易位子Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；
第二部分來源于pSC101質粒的四環素抗性基因（tetr）；
第三部分來源于ColE1的派生質粒pMB1的DNA復制起點（ori）。
（2）pBR322質粒載體的優點
第一、具有較小的分子量。為了方便起見，大家統一規定pBR322質粒DNA分子核苷酸的計數從EcoRI限制酶的識別位點開始，并公認該序列…GAATTC…中的第一個T為核苷酸1，然后沿著從tetr基因到ampr基因按順時針方向順序計數。因此pBR322質粒DNA分子的正確長度是4363bp。
第二、具有兩種抗菌素抗性基因可供作掛化子的選擇記號。
第三、具較高的拷貝數，而且經過氯霉素擴增之后，每個細胞中可累積1000~3000個拷貝。這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。
2．pUC質粒載體
pUC載體是在pBR322質粒載體的基礎上，組入了一個在其5′—端帶有一段多克隆位點的lacZ′基因，而發展成為具有雙功能檢測特性的新型質粒載體系列。
(1) pUC質粒載體的結構
典型的pUC系列的質粒載體，通常包括如下四個組成部分：
（1）來自pBR322質粒的復制起點(ori)；
（2）氨芐青霉素抗性基因(ampr)，但它的DNA核苷酸序列已經發生了變化，不再含有原來的核酸內切限制酶的單識別位點；
(3) 大腸桿菌β—半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α－肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ基因；
（4）位于lacZ′基因中的靠近5′端的一段多克隆位點(MCS ，multiple cloning sites)區，但它并不破壞該基因的功能。
（2） pUC質粒載體的優點
與pBR322質粒載體相比，pUC質粒載體系列具有許多方面的優越性，是目前基因工程研究中最通用的大腸桿菌克隆載體之一。其優點概括起來有如下三個方面：
第一、? 具有更小的分子量和更高的拷貝數?
在pBR322基礎上構建pUC質粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，使其分子大小相應地縮小了許多，如pUC8為2 750bp，pUCl8為2 686bp。同時，由于偶然的原因，在操作過程中使pBR322質粒的復制起點內部發生了自發的突變，導致rop基因的缺失。由于該基因編碼的共63個氨基酸組成的Rop蛋白質，是控制質粒復制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC質粒的拷貝數比帶有pMBl或ColEl復制起點的質粒載體都要高得多，平均每個細胞即可達500~700個拷貝。所以由pUC質粒重組體轉化的大腸桿菌細胞，可獲得高產量的克隆DNA分子。
第二，適用于組織化學方法檢測重組體
第三，具有多克隆位點MCS區，方便簡潔，節省時間。
pUC質粒載體具有與M13mp8噬菌體載體相同的多克隆位點，它可以在這兩類載體系列之間來回“穿梭”。因此，克隆在MCS當中的外源DNA片段，可以方便地從pUC質粒載體轉移到M13mp8載體上，進行克隆序列的核苷酸測序工作。同時，也正是由于具有MCS序列，可以使具兩種不同粘性末端(如EcoRI和BamHI)的外源DNA片段，無需借助其它操作而直接克隆到pUC質粒載體上。
（3）pGEM系列載體
pGEM系列載體是一種與pUC系列十分類似的小分子的質粒載體。在其總長度為2743bp的基因組DNA中，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ′基因。在后者還插入了一段含多個限制性內切酶的識別序列的多克隆位點。此序列結構幾乎與pUC克隆載體的完全一樣。
三、λ噬菌體載體
l．λ噬菌體的一般生物學特性
λ噬菌體為線形雙鏈DNA分子，長度約為49kb，在λDNA分子兩端各有12個堿基的單鏈互補粘性末端，當λ噬菌體進入細菌細胞后，其DNA可迅速通過粘性末端配對而成雙鏈環狀DNA分子，這種由粘性末端結合形成的雙鏈區域稱為cos位點。λ噬菌體是一個溫和噬菌體，其生活周期有二種不同的類型，即裂解周期和溶源性周期。在裂解周期中，λ噬菌體的DNA分子一旦注入寄主細胞中，便可借助于寄主的復制和轉錄系統的功能，使自身DNA大量復制同時合成大量的外殼蛋白，并組裝成大量(約100個)完整的噬菌體顆粒，最后，使宿主裂解并從細胞中釋放出來。
2．λ噬菌體載體
（1）改造
野生型的λ噬菌體不適于直接用作基因克隆的載體。主要原因有二：
①λDNA基因組大而且復雜，特別是其中具有許多基因克隆常用的限制酶識別位點(如5個BamHI位點、6個BglⅡ位點和5個EcoRI位點等)；
②λ噬菌體外殼只能接納一定長度(即相當于入基因組大小的75％~105％)的DNA分子。因此，λDNA只能作為小片段外源DNA分子(即2.5kb左右)的克隆載體。這一克隆容量顯然不能滿足大多數基因克隆工作的要求，必須對野生型λDNA進行改造。
（2）類型：
只具有一個限制酶位點可便于外源DNA插入的稱為插入型載體，含有二個限制酶切點，在兩個位點之間的DNA區段可以被外源DNA片段所取代的載體稱為取代型載體。
隨著體外包裝技術和寡聚核苷酸合成技術的發展，人們已經構建了許多帶有多克隆位點的λ噬菌體載體，現在常規使用的λ噬菌體載體，不少既可用作插入型又可用作置換型。總之，多克隆位點的引入不僅極大地擴展了λ噬菌體的克隆范圍，同時還大大地簡化了其操作技術。
3．λ噬菌體載體的主要應用
（1）基因組DNA文庫的構建；
（2）cDNA文庫的構建
（3）大容量載體(如粘粒等)中增殖的大片段外源DNA序列的亞克隆等。
四、 粘粒載體（柯斯質粒載體）
? 1．柯斯質粒載體的構建
??? λ噬菌體克隆外源DNA的能力，雖說其理論上的極限值可達23kb，但事實上較為有效的克隆范圍僅為15kb左右。當然，在一般的情況下，這樣大小的DNA片段已足夠容納一個完整的基因及其兩端的側翼序列(flankingsequence)。然而，大量的研究資料表明，許多基因的分子大小比正常預期的要大得多，有的可達35~40kb甚至更大。柯斯質粒，乃是一類由人工構建的含有且DNA的COS序列和質粒復制子的特殊類型的質粒載體。它們兼具有λ噬菌體的高效感染能力和質粒易于克隆選擇的優點，既能像質粒一樣在寄主細胞內復制，也能像λDNA一樣被包裝到噬菌體顆粒中去。其克隆能力為31—45kb，而且能夠被包裝成為具有感染性能的噬菌體顆粒。
2．柯斯質粒載體的特點
第一，具有λ噬菌體的特性。柯斯質粒載體在克隆了合適長度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效地轉導對立噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。進入寄主細胞之后的柯斯質粒DNA分子，便按照λ噬菌體DNA同樣的方式環化起來。但由于柯斯質粒載體并不含有且噬菌體的全部必要基因，因此它不能夠通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒。
第二，具有質粒載體的特性。柯斯質粒載體具有質粒復制子，因此在寄主細胞內能夠像質粒DNA一樣進行復制，并且在氯霉素作用下，同樣也會獲得進一步的擴增。此外，柯斯質粒載體通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重組體分子表型選擇標記，其中有一些還帶上基因插入失活的克隆位點。例如，在pHC79柯斯質粒基因組的PstI限制位點克隆，會導致ampr基因的失活；在BamHI和SalI限制位點克隆，又會造成tetr基因的失活。
第三，具有高容量的克隆能力。正如上面所述，柯斯質粒載體的分子僅具有一個復制起點，一兩個選擇記號和COS位點等三個組成部分，其分子量較小，一般只有5~7kb左右。因此，可以插入到柯斯質粒載體上并能被包裝成立噬菌體顆粒的最大外源DNA片段，即柯斯質粒載體的克隆極限可達45kb左右。這個數字比且噬菌體載體及質粒載體的最大克隆能力都要大得多。同時，由于包裝限制的緣故，柯斯質粒載體的克隆能力還存在著一個最低極限值。如果用作克隆載體的柯斯質粒的分子為5kb，那么插入的外源DNA片段至少得有30kb長，才能包裝形成具感染性的且噬菌體顆粒。由此可見，柯斯質粒克隆體系用于克隆大片段的DNA分子特別有效。
有關基因工程的論文(5)
基因工程藥物
姓名：陳劍云
學號：U201210914
班級：機械學院 測控1204班
摘要：自１９７２年ＤＮＡ重組技術誕生以來，生命科學進入了一個嶄新的發展時期。１９８２年美國禮萊公司推出基因工程胰島素，這是第一個人用基因工程藥物。從那時起，以基因工程為核心的現代生物技術已應用到農業、醫藥、化工、環境等各個領域。基因工程技術的迅速發展不僅使醫學基礎學科發生了革命性的變化，也為醫藥工業發展開辟了廣闊的前景，以ＤＮＡ重組技術為基礎的基因工程技術改造和替代傳統醫藥工業技術，已成為重要的發展方向。
關鍵詞：基因工程 制藥 應用
基因的定義：基因是脫氧核糖核酸（DNA）分子上的一個特定片段。不同基因的遺傳信息，存在于各自片段上的堿基排列順序之中。基因通過轉錄出的信使使核糖核酸（mRNA），指導合成特定的蛋白質，使基因得以表達。
基因工程定義：基因工程又稱基因拼接技術和DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎， 以分子生物學和微生物學的現代方法為手段， 將不同來源的基因(DNA分子)，按預先設計的藍圖， 在體外構建雜種DNA分子， 然后導入細胞， 以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、 生產新產品。
基因工程藥物定義: 基因工程藥物又稱生物技術藥物,是根據人們的愿望設計的基因,在體外剪切組合,并和載體DNA 連接,然后將載體導入靶細胞(微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞) ,使目的基因在靶細胞中得到表達,最后將表達的目的蛋白質純化及做成制劑,從而成為蛋白類藥或疫苗。
基因工程藥物的發展歷程：自1972年DNA重組技術誕生以來,作為現代生物技術核心的基因工程技術得到飛速的發展。1982年美國Lilly公司首先將重組胰島素投放市場,標志著世界第一個基因工程藥物的誕生。美國是現代醫藥生物技術的發源地,也是率先應用基因工程藥物的國家,其基因工程技術研究開發以及產業化居于世界領先地位。美國已擁有世界上一半的生物技術公司和一半的生物技術專利。據1998年美國藥學會統計,美國FDA已批準了56種生物技術醫藥產品上市,其中絕大多數為基因工程藥物。此外,還有200多種基因工程藥物正在進行臨床試驗,其中至少有1/5的產品將可能在今后10年內上市。基因工程藥物為美國的一些公司創造了豐厚的回報,取得了巨大的經濟效益和社會效益。歐洲在發展基因工程藥物方面也進展較快,英、法、德、俄等國在開發研制和生產基因工程藥物方面成績斐然,在生命科學技術與產業的某些領域甚至趕上并超過了美國。
我國基因工程藥物的研究和開發起步較晚,直至20世紀70年代初才開始將DNA重組技術應用到醫學上,但在國家產業政策的大力支持下,這一領域發展迅速,逐步縮短了與先進國家的差距。1989年我國批準了第一個在我國生產的基因工程藥物———重組人干擾素重組人干擾素αIb,標志著我國生產的基因工程藥物實現了零的突破。重組人干擾素αIb是世界上第一個采用基因克隆和表達的基因工程藥物,也是到目前為止唯一的一個我國自主研制成功的擁有自主知識產權的基因工程一類新藥。從此以后,我國基因工程制藥產業從無到有,不斷發展壯大。截止1998年底,我國已批準上市的基因工程藥物和疫苗產品共計15種，國內已有30余家生物制藥企業取得基因工程藥物或疫苗試生產或正式生產批準文號。至2000年,我國已有200多家生物技術公司,有20多家生產銷售人干擾素、白細胞介素、乙肝疫苗等12種基因工程藥物。
基因工程藥物的本質是蛋白質，生產基因工程藥物的方法是：將目的基因連接在載體上，然后將導入靶細胞（微生物、哺乳動物細胞或人體組織靶細胞），使目的基因在靶細胞中的到表達，最后將表達的目的蛋白質提純做成制劑，從而成為蛋白類藥或疫苗。若目的基因直接在人體組織靶細胞表達，就稱為基因治療。
基因治療：基因治療就是從遺傳物質本身，即基因入手，不必產生或純化基因的最終產物，而是將基因，通常是通過一個載體直接導入人體，再利用人體自身就具有的基因復制、轉錄與翻譯功能來產生這些產物，達到補充正常基因產物或對抗異常基因的目的。將基因導入哺乳類動物細胞的方法有兩種，一類是理化方法，一類是病毒介導的DNA轉移。
利用基因工程技術生產藥品的優點在于：大量生產過去難以獲得的生理活性物質和多肽；挖掘更多的生理活性物質和多肽；改造內源生理活性物質；可獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源。
基因藥物的發展前景
與傳統制藥相比，生物制藥有便于大規模生產、利潤高、生產工藝簡單、人力投入少、無污染、生產周期短等優點，因此，隨著人類基因組計劃的實施和科技水平的進一步發展，基因藥物在醫藥市場的比例也將會日益提升，也將越來越影響人類的生活。
基因藥物同時具有高投入、高收益、高風險、長周期的特征。 Frost&Sullivan公司的一份最新報告指出，2004年，全球生物制藥市場的收入為450億美元。到2011年，其有望達到982億美元。據預測，全球第一個用轉基因植物生產的生物藥物可望于2005～2006年上市。隨著公眾認知度的提高和相關法規的逐步完善，用轉基因植物生產生物藥物的市場將飛速增長，到2011年，單美國市場就將達到22億美元。 2002年底到2003年5月間一場突如其來的SARS疫情，再加上2005年度禽流感病毒傳播，席卷了亞洲及加拿大等地。在緊張而又嚴肅的應對這場疫情的過程中，生物制藥又成為醫藥行業人士關注的焦點。
我國生物制品需求巨大，過去的幾年我國企業一直能保持年均15％以上增幅，并且近年來銷售的增長速度有加快的趨勢。據統計，2005年國內生物制品銷售收入總額為157．4億元人民幣，銷售利潤總額為38.7億元人民幣。預計到2006年生物技術工業總產值將達400億到500億元，到2015年總產值可達1100億到1300億元。 我國的生物制藥業將進入一個快速發展的階段,生物醫藥工業將成為醫藥產業增長最快的部分。目前,我國許多省市已將生物制藥作為本地的支柱產業重點扶持。一大批生物醫藥科技園相繼在各地高新技術開發區建成。面對入世帶給我國生物制藥業的挑戰和機遇,專家們預測,在未來若干年,我國的生物制藥業將以超過全球平均增長速度步入高速發展軌道,前景十分廣闊。
基因工程藥物的發展概況
20世紀70年代，隨著DNA重組技術的成熟，誕生了基因工程藥物，高產值、高效率的基因藥物給醫藥產業帶來了一場革命，推動了整個醫藥產業的發展，醫藥產業進入了新的歷史時期。基因藥物經歷了三個階段：第一階段是把藥用蛋白基因導入到大腸桿菌等細菌中，通過大腸桿菌等表達藥用蛋白但這類藥物往往有缺陷，人類的基因在低等生物的細菌中往往不表達或表達的蛋白沒有生物活性。第二階段是人們用哺動物的細胞代替細菌，生產第二代基因工程藥物。第三階段是到了80年代中期，隨著基因重組和基因轉移技術的不斷發展和完善，科學家可以將人們所需要的藥用蛋白基因導入到哺乳動物體內，使目的基因在哺乳動物身上表達，從而獲得藥用蛋白。
基因工程技術制藥展望
基因工程技術在醫藥工業中的應用非常廣泛，利用基因工程技術開發藥物已成為當前.最為活躍和迅猛發展的領域。隨著人類基因組計劃的完成，以及基因組學、蛋白質組學、生物信息學等研究的深入，為醫藥生物技術開拓了一個新的領域，基因工程制藥將有更多機會獲得突破性進展，為保障人類健康做出更大的貢獻。
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有關基因工程的論文(6)
基因工程論文轉基因論文：
植物抗病基因工程研究進展
摘要隨著植物抗病基因的分離,植物抗病機制的分子生物學和植物抗病基因工程取得了重大研究進展。該文就植物抗病基因工程的原理、目的基因、轉化方法等進行綜述,并對植物抗病基因工程的應用前景做了展望。
關鍵詞植物;抗病基因;基因工程;原理;目的基因;轉化方法;前景
中圖分類號S432.23;Q78文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2010)16-0053-02
Advancesinthe ResearchofPlant DiseaseResistanceGeneticEngineering
HE Ming
(Research and Development Center for Fine Chemicals of Guizhou University,Guiyang Guizhou 550025)
AbstractWith the isolation of plant disease resistance genes in recent years,it made significant progress that molecular biology of plant disease resistance mechanisms and genetic engineering of plant disease resistance.The principle,targeting genes,transformation methods and view of application prospect of plant disease resistance genetic engineering were summarized.
Key words plant;disease resistance genes;genetic engineering;principle;targeting genes;transformaion methed;view of application prospect
有關基因工程的論文(7)
基因治療在傳染病防治中的應用研究進展
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[摘要] 傳染病是目前人類所面臨的一類重大疾病，在某些疾病狀態下，人類還未尋找到理想的治療方法，如病毒感染等。現代基因治療是一種應用基因工程技術和分子遺傳學原理，對人類疾病進行治療的新療法。主要是指對致病基因的修正和基因增強及采用外源性細胞因子基因、核酶、基因藥物進行疾病治療的方法。經過幾十多年的發展，技術逐步走向成熟，在傳染性疾病的防治中顯示了重大的臨床應用前景。傳染性疾病的基因治療包括：基因疫苗、RNA干擾、胞內抗體、淋巴基因表達等。
[關鍵詞] 基因疫苗 RNA干擾 胞內抗體 淋巴基因表達
1. 現狀
1.1 我國傳染病現狀 21世紀人類依然面臨著傳染病的挑戰首先，是新發傳染病的挑戰。就全球而言，艾滋病是當前首惡，因其主要通過血液、吸毒、性行為傳播，潛伏期長、隱襲性強、控制難度大；特別是婦女感染率高且可以垂直傳播，嚴重危害兒童的身體健康。由于其病毒極易發生變異，所以到目前為止疫苗仍在試驗階段，缺乏理想的特效藥物，免疫損傷治療難度大，以致非洲個別國家感染人數達其全國人口的一半。我國2003年比2002年發病率上升44．39％，人類免疫缺陷病毒檢出率提高了55％。2004新年伊始在東北亞韓國、日本及東南亞越南、泰國、柬埔寨以及中國和美國部分地區禽流感暴發，導致大量家禽死亡，同時H5N1病毒在人群感染使20多人喪命，又一次引起全球震驚。更有嚴重者，引起瘋牛病(在人類稱為克雅克病)的朊毒蛋白對煮沸等常用消毒方法不起作用，疾病潛伏期長，病死率高達100％。這兩種傳染病不但對人類健康造成了威脅，而且給人的兩種主要食物—— 牛肉、禽肉的供應造成困難。由于人與動物關系的密切，氣候的變化，以及化學物質的廣泛應用，微生物發生變異導致新的傳染病，甚至恐怖主義制作生物武器，人類勢必將面臨更多的新的挑戰。其次，老的傳染病對人類健康的影響同樣不容忽視。以2002年為例，WHO統計全球發生各類傳染病共計356 824 000例次，占各病種總發病數的23．9％，位居第一，死亡共11 122 000例，占19．5％ ，僅次于心血管病? 。這說明就全球而言，特別是發展中國家，傳染病不可忽視。據中國疾病預防控制中心報道，我國傳染病同年發病2 320 764例，死亡4520例，病死率0．0195％ ，均遠低于全球平均水平。但近年除新發傳染病外，傳統性傳染病一些情況值得我們注意：(1)發病數和發病率：我國2002年全國傳染病報告發病數2 440 588例次，發病率比2001年下降了5．74％ ，而2003年發病數2 591 512例次，發病率比2002年上升5．45％ 。(2)死亡例數和病死率：從死亡人數看，2002年死亡4520例，比前一年死亡3576例增加了26．4％ ，且2003年比2002年同期又上升了17．43％ ，增加了1280例。2003年死亡人數中死于SARS者349例，狂犬病1980例，且后者比2002年增加821例，高于SARS。(3)病種分布：2002年和2003年發病數居前3位的均是病毒性肝炎、結核與細菌性痢疾，死亡人數居前3位的是狂犬病、肺結核及病毒性肝炎，其中乙型病毒性肝炎及結核無論發病率及死亡數均居前3位。乙型肝炎療效有限，加上慢性化、肝硬化及部分發生肝癌呈鏈式發展，危害人民健康。同樣，最老的傳染病結核主要由于耐藥增加近年全球復燃，我國亦面臨結核的嚴重挑戰。2003年其余死亡數位居前10位的其他傳染病還有新生兒破傷風、艾滋病、乙型腦炎、SARS、細菌性痢疾、出血熱、流行性腦脊髓膜炎。其中除SARS及艾滋病外，均是老的傳染病控制不力出現反復。兒童傳染病死亡原因以破傷風、中毒性菌痢、麻疹與流行性腦膜脊髓炎為主，說明傳染病主要危害兒童的特點，影響了國家優生優育的大計[3]。
1.2 基因治療研究現狀
1.2.1 多種疾病的基因治療 目前，基因治療的范圍已從過去罕見的單基因疾病擴大至常見的單基因疾病和多基因疾病。遺傳性疾病的基因治療多數屬于單基因缺陷所引起的疾病的基因治療。Fang等以腺病毒為載體，靶向肝細胞對苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺陷癥小鼠模型進行了研究，結果表明小鼠的傷寒表型癥狀得到明顯改善。而un等則通過反轉錄狀病童T淋巴細胞中苯丙氨酸羥化酶(PAH)活性的改變狀況。惡性腫瘤的基因治療已進行了大量的預備性實驗，美國科學家構建了重組的TIL(腫瘤浸潤淋巴細胞)，能表達100倍于正常水平的TNF并應用于黑色素瘤的臨床治療。另外，用表達IL-2、IFN．2和IL廣1的TIL治療神經母細胞瘤及白等的研究工作也已見報道；還有應用反轉錄病毒將毒素基因(蓖麻毒素和脊髓灰質炎病毒素中所含的一種蛋白酶的基因)導人癌細胞內，只在靶細胞內表達毒素并發揮殺傷作用，但對其他細胞毒性較低。對于艾滋病等傳染類基因疾病，有研究將HIV LTR3’、5’寡腺苷酸合成酶雜合基因轉染HeLa．T4+細胞。結果表明：經修飾的帶有CD4受體的細胞具有抗HIV感染的作用。還有將編碼可使艾滋病毒HIV RNA降解的核酶基因轉染人淋巴細胞，從而抑制HIV的傳播。
1.2.2 多種藥物的基因治療隨著對基因治療機制本身的不斷深人探討，用于基因治療的藥物形式也不斷創新。基于三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸("rro)的反基因技術能夠通過阻止基因轉錄和DNA復制而達到治療目的。Cohen等曾用此技術抑制淋巴瘤的bc1．2基因，而Noonberg等以此對乳腺癌的HER2基因進行了相應的探索。基因治療從傳統意義上的DNA治療擴展至RNA水平。有治療作用的目的基因的mRNA已用作體內、體外基因治療的研究。Nair等Is J從腫瘤細胞或活組織分離出mRNA，以其對自身提呈抗原的樹突細胞進行轉染，最終表達出了初始癌抗原(CEA)一T淋巴細胞特異性細胞毒素。Thierry等采用體外轉錄的方式，以GFP為報告基因，研究了mRNA在人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、鼠黑色素瘤細胞B16．F10、人海拉細胞(子宮頸癌組織細胞株HeLa)、鼠成纖維細胞Ratl等不同細胞系中的表達狀況，同時還探討了不同轉染試劑對轉染效果的影響，并以蜂毒素肽介導并提高了mRNA的轉染效率。
1.2.3 多種途徑的基因治療在探討不同疾病的發病機制、嘗試不同基因藥物，進行基因治療的同時，有研究者對基因治療的新方法新途徑進行了大膽的探索。斯坦福大學研究組采用轉座子作為基因載體，在患有血友病的小鼠模型上，將來自魚的一種編碼轉座酶的基因與宿主染色體上的凝血因子Ⅸ 基因相連接，使小鼠的血液凝結狀況大大改善。基因槍法被證明能夠介導外源基因快速進人靶器官。Takuji等利用基因槍將成骨蛋白．1基因轉入椎間盤細胞中并使其獲得有效表達。Weiss等利用基因槍將包裹的細菌疏螺旋體OspC蛋白基因打人Balb／c小鼠體內，介導了Th2反應，并與注射方式進行比較，發現基因槍只介導Th2反應而非Thl反應的原因并非是由于相比注射方式其所輸送的DNA數量太少，于CpG的臨界濃度所致。利用消化道大量的黏膜表面以及其中所含有豐富的免疫介導組織，以口服的方式將具有治療或免疫作用的目的基因1199運送到靶器官已成為基因治療領域研究的熱點。在以腺病毒為載體對腸上皮細胞進行轉導的研究中，During等Luj將帶有lacZ基因的腺伴隨病毒口服給乳糖不耐癥的小鼠模型，在祖干細胞、腸道細胞、固有膜細胞中，外源基因的表達可持續六個月。MacLaughlin等用殼聚糖作為運送報告基因(編碼氯霉素乙酰轉移酶基因)的載體，經消化道后在體內得到表達。另外，Sizemore等發現當減毒的志賀氏菌進人細胞傳遞質粒后，質粒編碼的B半乳糖苷酶引起黏膜免疫。Ayub等用減毒的沙門氏菌為載體，攜帶李斯特病菌的單細胞基因毒力因子，對小鼠管飼后發現明顯的細胞毒性及輔助T細胞反應，同時也檢測到特異性抗體的產生[4]。
2. 基因治療的方法
2.1 基因疫苗 基因疫苗及DNA疫苗是20世紀90年代發展起來的第3代疫苗。其原理是將編碼病原體抗原的基因分離純化，克隆至真核細胞表達質粒載體，經皮下、肌肉注射或口服等方式進入機體，基因在體內表達相對應抗原并刺激機體免疫系統產生特異性免疫應答，從而使機體獲得針對病原微生物、病毒的特異性抵抗能力，達到預防和治療傳染病的目的。與傳統的第1代疫苗一減毒、脫毒病原微生物成分及第2代疫苗一基因工程蛋白多肽相比，基因疫苗具有能把抗原以自然狀態形式提供給機體、保護力強、無毒力回復并對不同亞型病原體產生交叉抵抗、易于制備和聯合接種、生產成本低、易于保存和運輸等優點，已成為具有廣泛應用前景的新型生物技術。它不僅可用來預防和治療細菌、病毒、寄生蟲等傳染性疾病，而且在腫瘤、自身免疫性疾病的治療中具有重要的價值。DNA疫苗是利用分子生物學技術，根據編碼抗原堿基序列，設計并合成特異性引物，用RT—PCR方法從病原微生物RNA分離純化抗原基因，再通過限制性內切酶方法將DNA克隆至真核細胞表達質粒載體。通過特定的方法將質粒載體制備成注射制劑或口服制劑。當這種制劑進入機體后通過載體的作用，DNA可進入機體細胞，在細胞內表達。病原抗原滯留于細胞內或分泌到細胞外，滯留于細胞內的抗原可特異性活化CD8+ Tc細胞，分泌到細胞外的抗原可活化CD4+ Th細胞或刺激B細胞產生抗體。因此，DNA疫苗不僅可誘導體液免疫，還可誘導細胞免疫，比傳統疫苗只誘導體液免疫具有顯著的優越性[1] 。
2.2 RNA干擾 RNA干擾主要是利用雙鏈RNA在mRNA水平關閉特異序列基因表達或使其沉默的過程，又稱轉錄后基因沉默(post—transcriptional gene silencing．PT—GS)，能特異性使外源性入侵基因沉默。RNA干擾最早在植物和線蟲細胞中發現，被認為是它們抵抗病毒感染的一種天然免疫防御機制。目前普遍認為其機制是核糖核酸酶首先將雙鏈RNA切割成21～23個核苷酸的片段，然后酶又與片段結合，由這些片段將酶引導至特異的mRNA上，從而降解mRNA，使特異基因沉默，抑制基因表達[1]。
2.3 胞內抗體 胞內抗體是一種基因工程抗體。其方法是采用分子生物學手段，從免疫脾細胞或雜交瘤細胞分離純化抗體VH和VL基因片段。再通過特定的連接肽將VH和VL連接起來，構建單鏈抗體(ScFv)基因，并在基因上加上細胞滯留信號序列，將該基因克隆至真核細胞表達質粒載體，通過特定的方法將質粒載體制備成注射制劑或口服制劑。當這種制劑進入機體后通過載體的作用，DNA可進入機體細胞，表達單鏈抗體定向分布于細胞的核、胞漿或特定細胞器中與病毒蛋白結合，干擾病毒蛋白的分泌、加工和活性，從而阻止病毒復制和病毒顆粒組裝釋放[1]。
2.4淋巴因子轉基因表達 淋巴因子在傳染病治療中具有十分重要的作用和廣泛的應用前景。其中的干擾素（IFN）已成為目前抗肝炎病毒治療唯一公認有效的基因工程藥物。利用淋巴基因表達進行傳染病的基因治療研究，是基因治療在傳染病中的一個重要應用和重要的研究方向[2]。
2.5 反義RNA 彭國平[5]綜述中談到HBV、HCV是引起慢性肝炎以及肝硬化、肝細胞肝癌等相關疾病的重要病原體，而有效防治此類肝病的關鍵在于抗病毒，反義核酸技術最早是人工合成或生物合成特定互補的DNA或RNA 序列導入靶細胞，形成mRNA—DNA 或mRNA—RNA雜交雙鏈，從而抑制或封閉靶基因表達，達到基因控制和治療的目的[5]。
3. 基因治療在傳染病防治中的應用
3.1 DNA疫苗 乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因疫苗在國外已進入I期臨床實驗，其結果顯示：該疫苗可在體內有效表達HBsAg，并可誘導強烈的免疫反應，產生高效價抗體，同時，志愿者對疫苗具有良好的耐受性。我國科學家將S抗原基因與IL一2、INF基因連接在同一載體上，構建融合基因給健康小鼠、HBV轉基因小鼠使用后，發現CTL活性顯著升高，HBsAg特異T細胞增殖能力顯著高于對照組，血清抗HBs抗體顯著升高。HIV一1基因疫苗在動物體內可產生有效的免疫應答，減少病毒顆粒釋放和對T細胞的損害，在人體內的實驗證明它可有效誘導抗HIV抗體產生。沙眼衣原體MOMP—DNA疫苗給小鼠免疫后可有效誘導抗體產生，其效價高達1: 1250，脾細胞對衣原體的刺激指數顯著高于對照組，說明該基因疫苗不僅誘導了體液免疫，同時還誘導了細胞免疫[1]。
3.2 RNA干擾(RNAi) 近年來隨著對RNA干擾研究的深入，一種能在哺乳動物細胞中抑制特異基因表達、只有21個核苷酸的小干擾雙鏈RNA(small interfering RNA，siRNA)被發現。將特異的siRNA通過陽離子脂質體轉入Hela細胞和人胚腎293細胞等不同哺乳動物細胞中，獲得了可重復的序列特異的RNA干擾，而將長序列的雙鏈RNA轉入則出現了非特異抑制。這些研究成果為RNA干擾的研制提供了前提。Randall等人發現HCV特異的siRNA可抑制AC和Huh一7肝細胞株中HCV復制，清除細胞內HCV病毒[1] 。
3.3 胞內抗體 在傳染性疾病，尤其是病毒感染中的應用越來越受到人們的關注。抗HIV結構和功能蛋白scFv基因導入HIV感染的淋巴細胞后能干擾HIV病毒轉錄和復制，而對細胞生長和CD4表達無影響，將其導入表達有CD4和CCR的人骨肉瘤細胞，可抵抗HIV的感染。抗HIV逆轉錄酶和抗整合酶的胞內抗體可抑制酶活性，減少病毒復制。抗CCR5和CD4的胞內抗體可抑制CCR5和CD4的表達并防止HIV感染。抗HCV外膜蛋白E2的胞內抗體能抑制病毒與靶細胞結合，發揮治療作用。抗HCV核心抗原的ScFv能抑制核心蛋白功能和HCV的裝配。我國研究者成軍等人報道：將抗HBV核心抗原SeFv基因克隆至逆轉錄病毒載體，構建的重組逆轉錄病毒感染2 215細胞后能有效抑制Ⅶ 和HBsAg的表達[1]。
3.4 干擾素的基因轉移與表達 Seif等將小鼠的干擾素β（IFNβ）的基因置于主要組織相容性復合體（MHC）的啟動子序列的控制之下，構建重組表達載體，轉染Babl/c小鼠的成纖維細胞系NIH3T3，得到了持續的IFNβ的表達。表達IFNβ的細胞系，對濾泡口炎病毒（VSV），腦心肌炎病毒（EMCV）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus）的復制和表達均有明顯的抑制作用。并發現持續低水平的IFNβ的分泌表達，就可以使這一細胞系產生明顯的抗病毒狀態。然而，用等量的外源重組的IFNβ則無此效果。而且，加入相應的IFNβ的單克隆抗體并不能阻斷這種轉導的細胞系對上述三種病毒的抑制效應。因此認為，此細胞系的抗病毒狀態的產生，除了和分泌型IFNβ的表達有關以外，還有可能存在其它的作用方式。另外，Bednarik等將人的α2干擾素（IFNα2）的基因重組到人免疫缺陷病毒（HIV）的長未端重復序列（LTR）中的啟動子下游，轉入非洲綠腎細胞系中，IFNα2的分泌表達水平持續在50~150u/ml之間。這一低水平的IFNα2的表達完全可以抑制HIV的復制和轉錄。同樣地也發現就用相應水平的外源重組的IFNα2也無此效果。而且IFNα2的單抗也不能阻斷IFNα2的抗病毒作用。這一差別的原因，作者認為體內產生的IFNα2與體外重組的IFNα2的抗病毒機理不同。外源重組的IFNα2的抗病毒機理，是抑制HIV的成熟和裝配過程，而內源表達的IFNα2的抗病毒作用，似乎是主要作用在轉錄水平以及HIV mRNA的穩定性等方面[2]。
4 問題與展望
基因治療在染性疾病的體內外實驗生物治療中均顯示了療效。尤其是基因疫苗對機體的保護作用已得到了公認，但其真正進入臨床廣泛應用尚有一段距離。還有許多問題須要進一步的驗證： 4.1 基因疫苗編碼抗原的表達問題。基因疫苗使用時進入機體的是一段DNA片段，其作用的發揮須要DNA在細胞內有效轉錄和翻譯成相應的蛋白，如何能使DNA高效率進入機體細胞并得到高效轉錄和翻譯；
4.2 DNA疫苗目前的動物實驗顯示其免疫效果存在較大的個體差異，總的來看其免疫原性不高
4.3 RNA干擾目前雖然是一個研究熱點，但其研究工作才起步，其導人體內的方法、穩定性等問題還需要解決；
4.4 基因治療的安全性問題，尤其是選用的載體對機體的影響還須要進一步證實，這一問題在短時間內無法解決。
4.5 倫理道德方面的爭論也是影響因素之一。
4.6 基因轉移中的副作用和抗體形成問題。
雖然基因治療還存在如此諸多問題，但它的理論基礎和強大生命力是顯而易見的。經過幾年來的發展，基因治療的研究已逐步從理論走向了臨床的實驗，人們已獲得了不少寶貴的知識與經驗，隨著分子生物學、免疫學的發展，人類及細菌、病毒等基因組測序的完成，為進一步發展和完善基因治療奠定了良好的基礎，相信不久的將來，基因治療將在傳染性疾病的預防和治療中發揮重要作用。
參考文獻
1. 顏漫江.基因治療在傳染病防治中的應用研究進展，傳染病信息2004，17（1）：14-15.
2. >
有關基因工程的論文(8)
基因工程的利與弊
劉建 20101103805
內蒙古師范大學生命科學與技術學院 生物科學（漢班）
呼和浩特 010022
摘要
基因工程對于人類的利弊一直是個爭議的問題，主要是這項技術創造出原本自然界不存在的重組基因。但它為醫藥界帶來新希望，在農業上提高產量改良作物，也可對環境污染、能源危機提供解決之道，甚至可用在犯罪案件的偵查。但它亦引起很大的憂慮與關切。當此科技由嚴謹的實驗室轉移至大規模醫藥應用或商業生產時，我們如何評估它的安全性？此項技術是否可能因為人為失控，反而危害人類健康并破壞大自然生態平衡？
關鍵詞：基因工程 轉基因 道德倫理
正文
生物學家早在一百多年前就知道，生物的表征遺傳自其親代。生物細胞的細胞核，含有染色體，其組成分為DNA。DNA含有四種堿基--腺嘌呤（adenine，），胸腺嘧啶（thymine，），胞嘧啶（cytosine，）和鳥嘌呤（guanine，（它們分別簡稱A、T、C、G）。這些堿基在DNA中看似雜亂無章，但它們的排列順序，正代表遺傳訊息。每三個堿基代表一種胺基酸的密碼。基因就是這些遺傳密碼的組合，亦即代表蛋白質的胺基酸序列。每個基因含有啟動控制區，以調控基因的表達。
基因工程技術（基因工程是一項很精密的尖端生物技術。可以把某一生物的基因轉殖送入另一種細胞中，甚至可把細菌、動植物的基因互換。當某一基因進入另一種細胞，就會改變這個細胞的某種功能。）在醫藥及農業上應用廣泛。這項尖端科技加上最近突破性的生殖科技，卻引發人們極大的隱憂及爭論。
觀點：辨證地看待基因工程的利與弊
基因工程對當今社會的發展功不可沒。
一、基因工程是在對促進生物學的發展具有重要意義
基因工程是在分子生物學、分子遺傳學、微生物學、細胞工程等學科發展和研究成果的基礎上誕生的，反過來也可促進現代生物學的發展。生物界是通過長期的進化發展而來的，因而通過基因工程手段，不僅可以闡明生命發生的現象和規律，揭示重要基因功能以及重要性狀形成的分子機制，還能模擬自然界生物進化歷程，更進一步豐富和完善生物進化的理論，促進生物學研究的全面發展。
二、基因工程在社會各個方面廣泛應用
醫藥業，可生產重要藥品，很大限度地降低生產成本；治療過去人們認為難以治愈的遺傳疾病和各類部分疾病，解除人類病痛煩惱，提高人體健康水平和人均壽命。
基因工程同時有望解決糧食危機和溫室效應之類的環境污染問題。
（1）基因工程用來篩檢及治療遺傳疾病。 遺傳疾病乃是由于父或母帶有致病基因。基因篩檢法可以快速診斷出該類基因；基因治療法則是用基因工程技術來治療這類疾病。產前基因篩檢可以診斷胎兒是否帶有某種遺傳疾病，這種篩檢法甚至可以診斷試管內受精的胚胎，早至只有兩天，尚在八個細胞階段。 試管胚胎就是其中的一個例子。做法是將其中之一個細胞取出，抽取DNA，偵測其基因是否正常，再決定是否把此胚胎植入母親的子宮發育。胎兒性別同時也可測知。 （2）基因治療法——遺傳病人的福音
目前醫學界正在臨床試驗多種遺傳病的基因治療法。最早采用基因治療的是一種先天免疫缺乏癥，又稱氣泡男孩癥（bubble-boy disease），患病嬰幼童因為腺脫胺（adenosine deaminase）基因有缺陷，骨髓不能制造正常白血球發揮免疫功能，必須生活在與外界完全隔離的空氣罩內。最新的治療法是由病人骨髓分離出白血球的干細胞，把正常的酵素基因接在經過改造不具毒性的反錄病毒（retrovirus），藉此病毒送入白血球干細胞，再將干細胞送回病人體內，則病人可產生健康的白血球獲得免疫功能。這項臨床試驗，在美國的女病童證明很成功。
（3）轉基因農業時代的到來
由于基因工程突破了不同物種間基因難以交流這一天然障礙，所以應用基因工程，通過跨物種的基因交流實現物種的定向遺傳改良或創造新物種，對自然環境及人類生活各個方面產生廣泛而深刻的影響。
在育種方面，它可應用于植物抗蟲、抗病、抗除草劑、抗逆等抗性遺傳改良以及培育高產量和高品質的動植物品種。目前全世界正重視發展永續性農業（sustainable agriculture），希望農業除了具有經濟效益，還要生生不息，不破壞生態環境。基因工程正可幫忙解決這類問題。基因工程可以改良農糧作物的營養成分或增強抗病抗蟲特性。可以增加畜禽類的生長速率、牛羊的泌乳量、改良肉質及脂肪含量等。
（4）農林漁牧的應用——生態環保
目前全世界正重視發展永續性農業（sustainable agriculture），希望農業除了具有經濟效益，還要生生不息，不破壞生態環境。基因工程正可幫忙解決這類問題。基因工程可以改良農糧作物的營養成分或增強抗病抗蟲特性。可以增加畜禽類的生長速率、牛羊的泌乳量、改良肉質及脂肪含量等。
（注：基因工程的應用并不只有以上部分，我只對以上部分發表個人觀點。）
金無足赤的基因工程
每一項科學技術都有他們的利與弊。在利用各項技術的同時我們應該衡量一下他們的弊，用最正確，對于大自然最和諧的方法去應用每一項科學技術。
目前有大部分人還不愿意吃轉基因食品，但轉基因食品已無處不在，我們無法預測這項技術所帶來的災難性后果，但我們清楚這種毀壞將是不可逆的。 1998年，美國媒體報導了對英國羅伊特研究所普斯陶教授的專訪，他警告人們關注未充分證明其安全性就已經推廣的轉基因食品，經過試驗：用轉基因土豆喂老鼠后，老鼠發生器官生長異常，體重和器官重量減輕，并且免疫系統遭到破壞。 ?1998年8月，英國教授普茲泰發現，老鼠食用了轉基因土豆之后免疫系統遭到破壞；美國也有一些害蟲的天敵因轉基因植物致死的報導；2005年5月22日，英國《獨立報》又披露了知名生物技術公司“孟山都”的一份報告，以轉基因食品喂養的老鼠出現器官變異和血液成份改變的現象。這些消息在帶給全世界震驚的同時，也使更多的人懷疑食用轉基因原料制成食品的安全性。
安全性問題
（1），未進行較長時間的安全性試驗：基因化食品改變了我們所食用食品的自然屬性，它所使用的生物物質不是人類食品安全提供的部份，未進行長時間的安全試驗，沒有人知道這類食品是安全的。
??? （2），產生毒素：基因化食品能產生不可預見的生物突變，會在食品中產生較高水平和新的毒素。Losey,J.E.等（1999）報導，在一種植物馬利筋葉片上撒有轉基因Bt玉米花粉后，普累克西普斑蝶食用葉片就少，長得慢，4天的幼蟲的死亡率44%。而對照組（飼喂不撒Bt玉米花粉的葉片）無一死亡。轉基因作物產生的殺蟲毒素可由根部滲入周圍，但尚不清楚會產生何種影響。
（3），過敏或變態反應：基因技術會在食品中產生不能預見的和未知的變態反應原。據報告，對巴西堅果產生過敏的主體也會對用該堅果基因工程化而得到的大豆產生過敏。科學家把巴西胡桃的特性移植到黃豆上去，結果卻使一些對胡桃過敏的人在攝取黃豆時有過敏的可能。植物凝血素（Lectin）對有些害蟲來說是有毒的，轉基因食品不得含有此類有毒物質。 ??（4），減少食品的營養價值或降解食品中重要的成份：基因化的目的是去除或滅活人們認為不需要的物質，這些物質可能是未知的，但它是基本的。比如它有自然的抑制癌癥的能力（Pariza,M.W.，1990）。美國的研究資料表明，在具有抗除草劑基因的大豆中，異黃酮類激素等防癌的成份減少了。基因化食品的虛假新鮮感迷惑消費者。具有芳香、有光澤的紅色蕃茄能貯藏幾周，但營養價值較低。消費者在購買水果或蔬菜時，僅依靠外觀和質地，因此，不能準確判定該產品的真實質量。營養物質在環境中自然循環受到轉基因微生物的干擾。 ??（5），產生抗菌素耐藥性細菌：基因技術采用耐抗菌素（如抗卡那霉素、氨芐青霉素、新霉素、鏈霉素等）基因來標識轉基因化的農作物，這就意味著農作物帶有耐抗菌素的基因。這些基因通過細菌而影響我們。英國的研究顯示，轉基因作物中的突變基因可能會進入到生物有機體，突變的基因如跨越種群和轉移至細菌，其結果可能會導致新的疾病。雖然這種機會可能性很小，但如出現無法治療的并廣泛傳播的對生命造成嚴重威脅的疾病時，其后果不堪設想。荷蘭科學家發表在《新科學家》雜志的試驗結果稱，設計一人造胃，對人消化轉基因食物的過程進行模擬，發現DNA滯留在腸內，同時一些轉基因細菌能夠把自己的抗生素抗性基因轉移給人造胃的細菌。如果類似結果發生在人和動物體內，就可能培養出功效最強的、抗菌素也無法殺死的超級細菌。英國新食品和工藝顧問委員會就禁止一種用抗氨芐青霉素基因作標識的轉基因改良玉米趨勢飼喂牛，因其中含有的DNA仍保持原樣，并有可能加速對抗菌素的抗藥性。 ??? （6），產生的問題不能進行追蹤：若不進行標識，我們的公共衛生當局就無力因出現問題發現其來源，潛在性的危害值得懷疑。 ??? （7），副作用能殺害人體：Mayeno,A.N.等（1994）報告，發生一種新的，不明原因的病癥，主要表現為嗜酸性肌痛。臨床表現有麻痹、神經問題、痛性腫脹、皮膚發癢、心臟出現問題，記憶缺乏、頭痛、光敏、消瘦（Brenneman,D.E.等，1993；Love,L.A.等，1993）。后查明系日本一公司生的基因化工程細菌產生的色氨酸所致。食用者在3個月后發病，導致37人死亡，1500人體部份麻痹，5000多人發生偶爾性無力。據測定，含量為0.1%便可殺死人體。
（8）轉基因植物對農田生態系統(Agro-ecosystem)的影響：
1.增加殺蟲劑的使用 ?2.抗性的選擇和轉運到可兼容的其它植物中 3.產生新的農田雜草基因流和雜交 4.轉基因植物自身變為雜草插入性狀的競爭 5.產生新的病毒
（9）倫理道德問題 人類在基因領域已經取得了巨大的進步，并通過基因工程在改變自然以服務于人的需要方面進展迅速。但是，在很長一段時間內，人類對基因工程的哲學倫理學方面的問題重視不夠。這有兩方面的問題。一方面，在改造自然和征服自然的哲學觀下，基因工程引發了許多生態問題，特別是極大影響了生物多樣性，而生物多樣性正是自然可持續發展的基礎。另一方面，基因工程引發了許多社會倫理問題。從克隆技術到人類基因組的重大發現以來，這一問題日益突出了，而與這一進程相比，人類相應的社會倫理體系卻沒有建立起來。
基因倫理學就其內容看，可有兩方面的內容，一方面是生態倫理學，一方面是社會倫理學。就基因的生態倫理學而言，主要是為了規范和協調基因工程與生態環境之間的矛盾；就基因的社會倫理學而言，主要是為了規范和協調基因工程與社會倫理方面的矛盾問題。
生態倫理學對于植物基因研究工作的規范和合理約束，主要是出于生物多樣性的考慮。近些年來，植物基因的研究取得了長足進步，這些進步推動了一系列農業革命，而尤以糧食革命為重。但是，這種以植物基因優化為基礎的革命，卻導致了物種多樣性的破壞。比如，它使人們食用的糧食從5000多種銳減到150多種。與此類似的是，化肥對增產和縮短生長期起了舉足輕重的作用，但也造成了土壤板結和地表破壞。同樣的情況也發生在動物基因的研究與應用中。比如，試管牛和試管羊為人們控制生物性別提供了基礎，這一技術使人類有可能實現對生物種群的控制。對某一種群來說，雄性數量不需要很多，但雌性數量卻舉足輕重，根據自然法則，雄雌出生概率大致相當，因此，如何在出生中盡量增大雌性數量和減少雄性數量就十分關鍵。但這樣一來，勢必造成種群雄雌比例的失衡，從而造成自然生態失衡。當這種技術應用于人類時，問題更大。前段時間關于克隆技術的討論表明，基因的克隆技術一旦用于人類，可能帶來或引起的麻煩甚至不是我們能夠想象到的。
隨著基因技術的發展，“天才論”、“血統論”有可能死灰復燃。“天才論”、“血統論”的問題在哲學史上由來已久，柏拉圖在《理想國》中，就曾以金銀銅等為血統論的合理性做了說明，這也在很長時期內存在于人類社會的歷史中，而且至今存在于不同的人種間。但類似凡高、愛因斯坦等許多已被證明的“天才”，在基因上可能恰恰是有缺陷的。事實上，基因技術本身也很難造成各方面能力均衡的所謂什么方面都正常的人。
【結語】 不久的將來，基因工程技術仍只限于轉殖少數的基因，如此培育出來的生物仍將是我們熟悉的生物。但是有很多疾病及生物特征是由多數基因決定的，而且基因常常不是獨立行使功能，它們會受環境的影響。譬如一組基因會造成某人罹患氣喘，但癥狀受生活的環境影響很大。一個人罹患糖尿病的機率，也與環境因子（飲食條件）息息相關。一個天才鋼琴家的音樂天賦包括聽力及靈敏的雙手巧妙地配合，這跟他的遺傳基因、童年音樂的啟發、生活環境等都有關連。所以我們在還未了解基因與環境因子的互動關系前，還不能奢望創造出具有超高智商的人，或是利用基因篩檢法篩選出具有特殊天賦的孩子。
21世紀是基因工程技術蓬勃發展的時代，基因工程的興起是生物革命的必然結果，盡管基因工程的隱憂及爭論眾說紛紜，但其給人帶來的好處是顯而易見的。希望隨著生物界的不斷發展，使基因工程的安全性得到保證，讓人們在生活的各個方面都能感受基因工程給人類帶來的利益。
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10.張惠展.2005.基因工程.上海：華東理工大學出版社
有關基因工程的論文(9)
生物工程進展論文
姓 名： 胡偉
學 院： 生物科學與工程學院
專 業： 生物工程
班 級： 生工142
學 號： 140302205
基因工程抗體進展
摘要：基因工程抗體是繼多克隆抗體和單克隆抗體之后的第三代抗體，近年來隨著生物工程技術的發展，許多基因工程抗體陸續問世，本文詳細介紹了基因工程抗體的研究進展，概述了基因工程抗體在臨床方面的明顯優勢和應用潛力。
關鍵詞：基因工程抗體；研究進展；臨床引用
轉基因技術迅速發展，其應用和發展的領域日益夸大。但轉基因技術的弊端日益凸現，引起眾多關注的目光。就轉基因技術本身而言，社會各界對它的態度各有異同。不同的國家不同的民族和不同的個體對轉基因技術的態度大相徑庭。如何看待轉基因技術？如何去應用和發展轉基因技術？這些都是我們亟待解決的問題。
1 基因工程抗體介紹
基因工程抗體是借助DNA重組和蛋白質工程技術，在基因水平對免疫球蛋白分子進行切割、拼接、修飾和重新組裝的一種新型抗體。所制備的抗體去除或減少了可引起副作用的無關結構，但保留天然抗體的特異性和主要生物學活性，并可賦予抗體分子以新的生物學活性的總稱。
由于目前制備的抗體均為鼠源性臨床應用時，對人是異種抗原，重復注射可使人產生抗鼠抗體，從而減弱或失去療效，并增加了超敏反應的發生，因此，在 80 年代早期，人們開始利用基因工程制備抗體，以降低鼠源抗體的免疫原性及其功能[2]。目前多采用人抗體的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗體的序列，經修飾制備基因工程抗體，稱為第三代抗體。
將識別效應細胞的抗體和識別靶細胞的抗體聯結在一起，制成雙功能性抗體，稱為雙特異性抗體。如由識別腫瘤抗原的抗體和識別細胞毒性免疫效應細胞（CTL細胞、NK細胞、LAK細胞）表面分子的抗體（CD3抗體或CD16抗體）制成的雙特異性抗體，有利于免疫效應細胞發揮抗腫瘤作用。
2 基因工程抗體的研究進展
主要是利用基因重組技術，把鼠抗體的重輕鏈可變區部分與人抗體重輕鏈恒定區的進行重組，減少鼠源結構，增加人源結構，而保持抗體與原抗原的特異性結合。
1.人的Ig重輕鏈可變區基因片段展示在噬菌體表面,組成抗體庫。
2.過噬菌體把抗體的表型和基因型相偶聯，易進行分子克隆和基因操作。
3.抗體庫的來源影響篩選結果（免疫和正常人）。
4.高通量篩選與抗原結合的抗體，但親和力低。
3.基因工程抗體藥物的應用
隨著生物工程技術的發展，許多基因工程抗體 陸續問世，并在醫學領域的許多方面都具應用潛力，如病毒感染、腫瘤、自身免疫性疾病、同種異體移植物注射、哮喘、中風和青光眼治療，尤其在診斷和治療腫瘤性疾病及抗感染方面優勢明顯。
惡性腫瘤的導向治療，是通過重組技術將抗腫瘤相關抗原的抗體與多種分子融合，這些分子在抗體結合靶分子后可提供重要輔助功能．這些分子包括：放射性核素、細胞毒藥物、毒素、小肽、蛋白、酶和用于基因治療的病毒．對腫瘤治療來說，設計的雙特異性抗體可有效針對低水平的腫瘤相關抗原，并將細胞毒物質輸送到腫瘤細胞．此外，抗體還可與攜帶藥物的脂質體、各種PEG偶聯，從而增強體內運輸和藥代動力學。作為免疫脂質體，轉鐵蛋白受體抗體可使藥物通過血腦屏障到達大腦．抗體酶復合物作為前體藥物也被用于基礎腫瘤治療。
基因工程抗體的進展已使抗體制備技術進入了一個全新時代，尤其藥物抗體庫的進展，解決了人源抗體的研制，促進了各種性能優良抗體以及具有多種功能的抗體融合蛋白的開發，可以預見基因工程抗體的研制正在進入一個新的高峰。但是抗體的親和力減弱，與完整抗體結構相比，功能明顯就會降低。人們對可能出現的新組合、新性狀會不會影響人類健康和環境，還缺乏知識和經驗，按目前的科學水平還不能完全精確的預測。所以我們要在抓住機遇，大力發展基因工程技術的同時，需要嚴格管理，充分重視轉基因抗體的安全性。
【參考文獻】
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有關基因工程的論文(10)
構建甲烷氧化工程菌降解甲烷的研究進展
摘要：對國內外甲烷氧化菌的研究現狀、甲烷氧化菌的分布、分類及其作用機理、運用DNA基因重組技術構建甲烷氧化工程菌等方面進行了簡述，并對運用甲烷氧化工程菌降解甲烷的前景進行了展望、提出現階段存在的問題和未來研究的方向。
關鍵詞：甲烷氧化工程菌；甲烷單加氧酶；降解甲烷；
1引言
甲烷是重要的化工原料和化學能源，在人類的生產生活中扮演著重要的角色。但甲烷同時也是一種溫室氣體,它引起的溫室效應是同等質量二氧化碳的20-30倍，由于甲烷排放的增加, 近200 年來其在大氣中的含量以每年1%的速度急劇上升,而大氣中甲烷含量的不斷增加，主要是由于甲烷排放源的增加和甲烷匯的減少,80％～90％的甲烷來源于生物活動，而甲烷的唯一生物匯為土壤里甲烷氧化細菌的氧化作用[1]。如果能夠合理有效地運用基因工程技術構建甲烷氧化工程菌并用其降解甲烷，不僅可以降低溫室效應從而保護環境，又可以產生巨大的商業價值，無疑有很重要的意義和很廣闊的應用前景。
2國內外甲烷氧化菌的研究現狀
甲烷氧化菌的研究一直受到科學工作者的關注，國內外已有很多科學工作者對甲烷氧化菌進行了比較深入的研究。其中包括對甲烷氧化菌的分類與分布、生理生化結構、催化作用機理以及甲烷氧化菌的特征酶甲烷單氧化菌（MMOs)的生化結構與功能、基因技術構建等方面的研究。West 等人[2]就使用T7 聚合酶表達系統使來自于M. capsulatus Bath 的sMMO的調控蛋白B 和還原酶C 在大腸桿菌內得到了活性表達，但是羥化酶組分卻表達不出活性。韓冰等[3]通過選用不同的啟動子和宿主細胞探索表達pMMO 的可能性, 結果得到了具有氧化甲烷活性的重組菌,但該重組菌的pMMO 活性不穩定,很多重組菌檢測到pMMO 蛋白的表達, 但沒有催化活性。
3甲烷氧化菌的分布、分類及其作用機理
甲烷氧化菌是一類能夠以甲烷作為唯一碳源和能源生長的革蘭氏陰性菌，廣泛存在于泥土、沼澤、稻田、河流、湖泊、森林和海洋中, 通常生存溫度為20-45 0C，基于甲烷氧化菌細胞形態、代謝類型不同, 甲烷氧化菌可以分為I型甲烷氧化菌和II型甲烷氧化菌。其中I型甲烷氧化菌采取的是戊糖磷酸途徑, 而II型甲烷氧化菌采取的是絲氨酸途徑[4] 。
3.1甲烷氧化菌降解甲烷的作用機理
甲烷氧化菌能夠以CH4 作為能源和碳源，氧氣為電子受體，通過甲烷單加氧酶將甲烷氧化為甲醇。1984 年Daiton 等人[5-6]首先證實了甲烷單加氧酶（MMOs）的催化機
理，即羥基化酶是MMO催化中心，它和甲烷、分子氧結合，使之活化。還原酶可以接受電子給體還原態煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的電子，進而為羥基化酶提供電子，調節蛋白B在還原酶和羥基化酶之間的電子傳遞過程中起調節作用。催化反應如下：
CH4 + O2 + H+ + NADH → CH3OH + H2O + NAD+
3.2 甲烷氧化菌的特征酶
甲烷單加氧酶（MMO）是甲烷氧化菌的特征酶，目前已知存在2種不同的類型即可溶
性甲烷單加氧酶（sMMO）和顆粒狀或膜結合甲烷單加氧酶（pMMO）。雖然這2種類型的甲烷單加氧酶在細菌內具有相似的功能，但兩者的基因和結構都存在差異性[7]。
3.2.1 sMMO的生化性質[8-9]
sMMO存在于細胞質中,不含卟啉鐵,許多的烴類化合物和芳香族化合物都能被其氧化。sMMO比pMMO具有更寬的底物專一性,能催化很多C8以下長鏈烷、烯、芳香族化合物氧化. 而且sMMO 降解部分環境污染物的能力比pMMO強, 如sMMO催化氧化三氯乙烯的速率是pMMO 的250倍。因此sMMO在清除有機污染物和生物催化合成方面具有更大的應用潛力。
3.2.2 pMMO的生化性質[8-9]
pMMO一般存在于細胞膜上，相對分子質量為94kDa[10]。基本上所有的甲烷營養菌中都含有pMMO,僅能催化甲烷和一系列短鏈烴的氧化,對少于五個碳的烷烴和烯烴具有更好的選擇性,其可以利用多種電子供體,甲烷氧化可以在更低的濃度下高效進行,其催化甲烷氧化的速度比sMMO 高60%左右，是自然界甲烷氧化反應的主要酶系。相對于sMMO 而言, pMMO的表達不會受環境中的Cu2+抑制, 更適合于工業應用。
4 應用基因技術構建甲烷氧化工程菌
雖然甲烷氧化菌具有重要的降解甲烷的工業應用潛力,但由于一些瓶頸問題,比如其只能以甲烷為唯一碳源進行代謝,由于甲烷氧化菌生長所需底物甲烷和氧氣均為氣體, 兩者在水中溶解度很低, 嚴重限制了細胞利用底物的速度，因此在通常的培養條件下甲烷氧化生長緩慢、細胞密度低、培養困難、發酵周期長。再就是已有的甲烷氧化菌種類有限和MMO在甲烷氧化菌內的表達量有限導致其濃度和反應速度無法滿足工業生物催化的要求等等，限制了甲烷氧化菌及MMO的工業應用[11]。通過基因工程的手段，構建具有降解甲烷能力的MMO基因的載體，導入可利用包括甲烷在內的有機物快速生長的宿主細胞中，進而構建高效降解甲烷超表達甲烷氧化工程菌，實現利用異源宿主表達MMO的工程菌株進行甲烷的生物催化。提高甲烷氧化菌的生長速度、細胞量及MMO的表達量，從而解決甲烷氧化菌通常的培養條件下生長緩慢、細胞密度低、MMO在甲烷氧化菌內的表達量有限等問題[3]，為甲烷氧化菌降解甲烷的工業應用提供新的方法。
4.1 構建甲烷氧化工程菌的基本過程
從甲烷氧化菌細胞中分離出控制降解甲烷的基因組DNA（即MMO的基因），用限制性核酸內切酶分別將外源基因和載體分子切開。
用DNA連接酶將含有控制降解甲烷的DNA片段接到載體分子上，構成DNA重組分子。
借助于細胞轉化手段將DNA重組分子導入可利用包括甲烷在內的有機物快速生長的宿主細胞中。
短時間培養轉化細胞，以擴增DNA重組分子或使其整合到宿主細胞的基因組中。
篩選和鑒定經轉化處理的細胞，獲得控制降解甲烷的基因高效穩定表達的宿主細胞，這就是成功構建的甲烷氧化工程菌。
5 甲烷氧化工程菌降解甲烷的前景、現存在問題和未來研究方向
5.1 對甲烷氧化工程菌降解甲烷發展前景的展望
可以想象，如果甲烷氧化工程菌降解甲烷的技術能夠走出實驗室，并能廣泛應用于實際的降解甲烷的話，那將是一個有多么重大意義的事情。甲烷氧化工程菌以其高效、專一、快速降解、無二次污染等優勢一定能夠在降解甲烷等方面大展身手。該技術可以運用于降解城市垃圾填埋場厭氧發酵產生的甲烷，從源頭上減少甲烷向大氣的排放，從而緩解全球的溫室效應。
礦井中瓦斯的含量過高而導致的礦難一直是一個嚴重的問題，而瓦斯的主要成分是甲烷，如果在煤層開采時在開采的煤層投放甲烷氧化工程菌，利用其高效快速氧化礦井中的瓦斯能力,降低礦井中的瓦斯濃度，有助于從根本上防治煤礦瓦斯災害。
與傳統的通過甲烷轉化為甲醇的工業合成的高耗能、成本高、效率低的特點相比，甲烷氧化工程菌降解甲烷技術生產甲醇反應條件溫和, 低成本、催化高度專一,在工業生產甲醇中利用該技術前景十分廣闊。這些僅僅是未來甲烷氧化工程菌降解甲烷在實際應用的幾個方向，將來亦可以將其運用于治理土壤、地下水等等，未來的社會足以為它提供保護自然環境，為人類服務和展示自己的舞臺。
5.2現階段存在的問題
雖然科學家們在構建甲烷氧化工程菌降解甲烷的研究上已經取得一些進展，但不能否認現在想讓甲烷氧化工程菌成功地應用于實際環境治理中和工業生產中還有很多的問題需要人們去解決。在甲烷單加氧酶的分離提純中，酶很容易失活；構建的宿主細胞中，甲烷單加氧酶的活性很低、不穩定，有的根本就沒有催化活性。這些問題都需要今后的進一步的研究。還有就是實際的自然環境不像實驗室中的實驗環境那樣具有可控性，其變化多端，環境惡劣，在實驗室中成功構建的有很好的降解能力的工程菌能否在自然環境中也能夠正常地生長繁殖和發揮其降解能力呢？甲烷氧化工程菌會不會對環境存在其他現在還無法估價的影響？會不會通過食物鏈進入人體而產生對人體有害的物質？這些問題暫時還不能很清楚地知道答案，都還需要人們今后不斷地研究和探索才能得到解決。
5.3 未來研究的方向
若想讓工程化甲烷氧化菌降解甲烷的技術真正使用在工業生產上，提高工程菌MMO的活性和其對環境中其他影響因子的耐受性是關鍵，因此在未來還要對工程菌里面MMO的催化活性、其對自然環境的適應性以及基因工程的安全性問題等方面進行深入研究。 在未來的研究中，可以用電腦程序設計出模擬實際自然環境的實驗環境，讓工程菌在模擬的實驗環境中生長、繁殖和降解甲烷。觀察并研究在實驗室中有很好的降解能力的甲烷氧化工程菌能否在模擬的自然環境中也能夠正常地生長繁殖和發揮其降解能力，從而加于改造并篩選出在實際的工業生產環境中能有很好的降解效果的工程菌。在未來的另一個研究方向是研究能否用DNA基因重組技術把一段有自殺功能的基因整合工程菌中，控制其在有甲烷的地方可以生存、繁殖并降解甲烷，一旦降解甲烷污染完成之后就啟動自身的自殺基因而自我毀滅，若能成功，DNA重組的工程菌運用于實際的甲烷治理中可能存在的基因安全性問題將得以有效解決。 相信隨著科技的不斷發展和人們對甲烷氧化工程菌與環境關系的研究的不斷深入，甲烷氧化工程菌將在降解甲烷和其他工業生產方面發揮其重要的作用，并不斷為人類造福。
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有關基因工程的論文(11)
綠色熒光蛋白的應用
09化學制藥 0932220026 唐駿
2008年的諾貝化學獎由日本科學家下村修（Osamu Shimomura）、美國科學家馬丁·沙爾菲（Martin Chalfie）和美籍華裔科學家錢永健（Roger Y. Tsien）因在發現和研究綠色熒
光蛋白方面做出貢獻而共同獲得。
綠色熒光蛋白(green f luo rescen t p ro tein,GFP) 是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動物體內的生物發光蛋白。當受到紫外或藍光激發時, GFP 發射綠色熒光。近年來, 隨著GFP 在各種異源細胞, 如細菌、昆蟲及植物細胞中的表達, GFP 作為一種新型的報告物在生物學界引起了廣泛的關注, 關于它的基本結構、生色團、發光機理及基因的改造均有大量的研究報道。它是一種操作方便, 不用加外源底物, 就能在活細胞中檢測的分子探針。將徹底改觀過去標記方面的研究方法, 在分子生物學研究中有廣闊的應用前景。
關鍵詞：綠色熒光蛋白 轉基因技術
綠色熒光蛋白的發現與發展
1962年， 下村修和約翰森等在《細胞和比較生理學雜志》上報道， 他們分離純化了維多利亞多管水母中的發光蛋白—水母素。據說下村修用水母提取發光蛋白時， 有天下班前， 他將產物倒進水池里。臨出門前關燈， 回望了一眼水池， 見到水池閃閃發光。因為水池也排放有養魚缸的水， 他懷疑是魚缸成分影響了光蛋白。然而不久之后， 他便確定鈣離子能增強光蛋白發光。
綠色熒光蛋白被發現20多年后，才有人將其應用在生物樣品標記上。1993年，馬丁·沙爾菲成功地通過基因重組的方法使得除水母以外的其他生物(如大腸桿菌等）也能產生綠色熒光蛋白，這不僅證實了綠色熒光蛋白與活體生物的相容性，還建立了利用綠色熒光蛋白研究基因表達的基該方法，而許多現代重大疾病都與基因表達的異常有關。至此，生物醫學研究的一場“綠色革命”揭開了序幕。 后來，美籍華人錢永健系統地研究了綠色熒光蛋白的工作原理，并對它進行了大刀闊斧的化學改造，不但大大增強了它的發光效率，還發展出了紅色、藍色、黃色熒光蛋白，使得熒光蛋白真正成為了一個琳瑯滿目的工具箱，供生物學家們選用。目前生物實驗室普遍使用的熒光蛋白，大部分是錢永健改造的變種。
1 GFP在轉基因研究中的應用特點
目前轉基因研究與應用的發展十分迅速，將GFP基因應用到轉基因研究中，具有其它基因所無法比擬的以下諸多優點。
1．1 GFP熒光穩定，易于檢測
GFP的熒光較穩定，抗光漂白能力比熒光素強，能耐受較長時間的光照。GFP在pH7—12范圍內都能正常發光；對高溫(70％)、堿性、除垢劑、鹽、有機溶劑和大多數普通酶等都有較強抗性"】。GFP中的發色團是由其一級結構中的一段三肽自然形成，該發色團的形成只需要氧氣，不依賴于酶或者其它輔助因子，僅以紫外光或藍光激發，即可發出綠色熒光。用肉眼、熒光顯微鏡均可以觀察到。且靈敏度高，還可進行表達量的半定量或定量檢測。
另外，GFP中氨基酸的替換可產生不同光譜特性的突變體，且增強了熒光強度，適合在不同物種中專性表達。Tsien卜川發展了顏色迥異的GFP突變體，包括藍色熒光蛋白BFP(blue fluorescent protein)、青色熒光蛋白CFP(eyan fluorescent protein)和黃色熒光蛋白YFP(yellow fluorescent protein)。隨著研究深人，抗酸、抗漂白、亮度高(消光系數與量子產率乘積)、成熟快及單體結構的GFP變體將越來越多，激發和發射光譜范圍也將不斷拓寬，對該蛋白的檢測將越來越容易。
1．2表達調控簡單，構建栽體方便
GFP中的發光團由一些常見的非特異氨基酸構建而成，它的翻譯后修飾過程不需要原有水母(A．victoria)細胞中任何其它成分或共因子，在細胞內呈自主表達。利用GFP發光時，只需要操縱細胞合成GFP蛋白，元需復雜的翻譯后加工過程，GFP就會自動折疊催化并開始發光，在微生物、植物、動物中都獲得了成功的表達。由于GFP分子量較小，只含有238個氨基酸，編碼GFP的基因序列也較短，約為2．6 kb¨1，所以它可以很方便地同其它序列一起構建多種載體，而不至于使質粒過大而影響轉化效率。
2 GFP在轉基因研究中的應用進展
2．1 用于篩選轉基因成功個體
外源目的基因轉入宿主后，能穩定整合的頻率低，通常是將攜帶有目的基因的載體轉到若干個宿主中，再從該若干個細胞(或其它)中篩選出成功轉化并表達目的基因的個體。因此，如何準確和有效地區分轉化與非轉化細胞、篩選轉化成功的個體是轉基因研究中重要的一步。在這一步中，科研工作者通常是在目的基因上游加一個篩選標記基因，利用篩選標記基因在移植前進行陽性篩選，僅把陽性細胞移入受體，則可大大提高轉基因動植物的成功率，減少轉基因個體篩選鑒定的工作量。目前常采用的篩選標記基因主要有：氯霉素乙酰轉移酶基因(CAT)，葡萄糖苷酶基因(GUS)，熒光素酶基因(Lue)，新霉素磷酸轉移酶基因(NPT)，潮霉素磷酸
轉移酶基因(HPT)等。利用這些標記基因時，有些需要復雜的樣品固定和制備過程、昂貴的底物；有些需要漫長的抗性篩選，對胚胎有一定的毒害作用；大部分還需要特殊的檢測手段，給轉基因研究工作增加了難度，均不夠理想。而將GFP應用于標記基因，可以避免以上缺陷，能夠有效、快捷的對轉基因個體進行篩選，大大提高了轉基因工作效率。黃國存等¨引分別用花粉管通道法和農桿菌介導法將攜帶有GFP基因的外源基因導入棉花，發現用手持紫外燈結合顯微鏡檢技術能夠快速地對轉化子進行活體篩選鑒定，明顯比GUS檢測方法優越。程在全等¨引用基因槍法將帶有綠色熒光蛋白基因的質粒pJPM5和pSBG700分別轉入水稻TNG67愈傷組織，在熒光顯微鏡下觀察到了綠色熒光蛋白基因的表達，綠色熒光蛋白基因表達出的綠色熒光蛋白信號比植株的自發熒光強得多，且不會受自發熒光的太大影響。因此，綠色熒光蛋白基因可以作為水稻(甚至小麥、玉米)轉基因研究中的報告基因。李華等¨刮將GFP表達質粒導人BHK、DK、RK等真核細胞，建立真核細胞轉基因指示系統，結果表明，GFP的表達對胚胎無損傷，又經濟簡便，可避免B一半乳糖苷酶等報告基因的不足，是提高基因轉移與篩選效率的理想途徑。Vain等第一次對抗生素篩選與GFP篩選進行了直接比較，研究表明GFP能大大提高轉化的工作效率，減少了轉基因植株分子檢測步驟和工作量。
2．2 用于尋找轉基因所需的啟動子、增強子等調控元件
基因的表達調控研究與轉基因研究相輔相成，用轉基因方法可研究基因的表達調控，而基因的表達調控研究可更好地指導并應用于轉基因研究。啟動子、增強子等是基因表達調控的重要元件，也是轉基因所需的組件。用不同的啟動子與GFP基因相連，構成不同的表達質粒，用于轉化合適的細胞，通過觀察細胞的熒光強度，就可以比較判斷啟動子的強弱，找出適合用于轉基因的啟動子。Clontech公司構建了一種叫啟動子報告載體(Promoter reportervector)，即沒有啟動子的GFP質粒，專門用來測試各種啟動子對GFP表達的效率，以及某些增強子對GFP表達的調控效果。用玉米C4PPDK基因5’端的非翻譯片段(5’UTR)與花椰菜花葉病毒的35S啟動子連接，GFP在玉米原生質體中的表達效率比對照質粒(只有35S啟動子)提高近15倍，因為5’UTR片段中含轉錄增強子¨“。將藍氏賈第蟲谷氨酸脫氫酶(GDH)啟動子和GFP構成融合基因，轉化賈第蟲，可以觀到綠色熒光，從啟動子的5’一末端進行逐步缺失，制備一系列突變體并構成融合基因，轉化藍氏賈第蟲，能確定出GDH啟動子核心序列。
2．3 用于探索不同物種的有效轉基因方法
轉基因的方法很多，適用于不同生物的轉基因方法也不同。在做轉基因之前，研究者必須先摸索出最有效的方法，以提高轉基因的成功率。目的基因構建到表達載體上后的表達情況通常是不清楚的(有許多表達條件需要摸索)，一旦檢測不到基因的表達，就很難判斷是轉基因方法不恰當，還是基因表達本身出現問題。所以如果直接用目的基因進行有效轉基因方法的探索，將給轉基因工作帶來很多困難。GFP的表達無種屬特異性、表達調及翻譯后修飾過程簡單易控制、通常表達量也很高，將目的基因替換為GFP基因進行不同生物轉基因最優方法的探索，將會縮小研究難度。
Rolling等¨副將腺相關病毒載體(AAV)與與GFP構建成rAAV．GFP重組質粒，經視網膜下腔注射到大鼠眼內，在整個試驗過程(4個月)中均能觀察到GFP的表達信號，說明AAV能夠有效地轉染視網膜色素上皮細胞(RPE)。Bennett等¨引將攜帶有GFP的cDNA重組腺相關病毒(rAAV)經視網膜下腔注射到成年的免疫活性小鼠眼內，用激光掃描眼底鏡進行觀察，試驗結果表明，rAAV能有效穩定地介導視網膜基因轉移而無明顯的毒性及免疫反應。楊國順等心剛利用GFP基因優化了辣椒的遺傳轉化體系。Hu等嵋川用電激法和PEG法同時轉化玉米和擬南芥菜(Arabidopsis)原生質體，GFP在玉米原生質體中表達，且PEG介導比電激法轉化效率高；而擬南芥菜原生質體中未觀察到GFP表達。但Sheen等糾利用基因槍(Microprojectile bombardment)轟擊擬南芥菜葉片和根組織，觀察到GFP的表達。宋軍等口糾以綠色熒光蛋白基因為目標基因，用脂質體轉染豬胎兒成纖維細胞，并以綠色熒光蛋白基因轉染后的陽性細胞作為體細胞核移植的核供體，以體外成熟卵母細胞為核受體構建了綠色熒光蛋白轉基因克隆豬胚胎，結果表明，脂質體轉染試劑可以高效轉染豬胎兒成纖維細胞，獲得的陽性細胞具有支持豬全程發育的潛能。
2．4提高轉基因產物的利用率
GFP分子量小，它能與多種蛋白質的N端或C端融合，其表達產物既保持了外源蛋白的生物活性，又表現出與天然GFP相似的熒光特性。許多表達的轉基因產物，特別是一些特殊蛋白，難以分離純化，而將GFP與目的基因進行融合表達，則使分離純化變得容易許多。還有研究表明，改變蛋白質的末端結構，與GFP融合，可以增加重組蛋白質的穩定性ⅢJ。Kaba等∽糾構建了編碼ECF(東海岸熱，牛的一種致死性原蟲病)子孢子表面抗原P67的重組桿狀病毒載體，結果只有低水平的表達，而P67基因與GFP的c端融合則出現較高水平的表達，重組融合蛋白能夠被P67單克隆抗體識別，非融合蛋白蛋白既具有原有的正常功能，又具有綠色熒光特性。岳莉莉等舊釗成功地實現了GFP與HBV(乙型肝炎病毒)抗原基因融合后在大腸桿菌中高效表達，得到既能發射熒光又具有抗原性的雙功能融合蛋白，為獲得一種新型發光免疫診斷試劑奠定了基礎。
結束語
綠色熒光蛋的發光機理比熒光素/熒光素酶要簡單得多。一種熒光素酶只能與相對應的一種熒光素合作來發光，而綠色熒光蛋白并不需要與其他物質合作，只需要用藍光照射，就能自己發光。 在生物學研究中，科學家們常常利用這種能自己發光的熒光分子來作為生物體的標記。將這種熒光分子通過化學方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。生物學家一直利用這種標記方法，把原本透明的細胞或細胞器從黑暗的顯微鏡視場中“糾出來”。 傳統的熒光分子在發光的同時，會產生具有毒性的氧自由基，導致被觀察的細胞死亡，這叫做“光毒性”，因此，在綠色熒光蛋白發現以前，科學家們只能通過熒光標記來研究死亡細胞靜態結構，而綠色熒光蛋白的光毒性非常弱，非常適合用于標記活細胞。
有關基因工程的論文(12)
基因工程
1 基因工程技術簡介
基因工程又稱為DNA重組技術，是以分子遺傳學為理論基礎，以分子生物學和微生物學的現代方法為手段，將不同來源的基因按預先設計的藍圖，在體外構建雜種DNA分子，然后導入活細胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產新產品。它是現代生物技術的核心內容，已成為現代高新技術的標志之一。可以將此技術應用于食品包裝、食品保藏、貯運等中，以改變包裝材料，降低生產成本；延長食物的貯藏期，改變傳統的貯運方式。如通過轉基因技術生產的延熟番茄，主要通過乙烯合成途徑調控，抑制乙烯合成，從而達到延遲成熟、耐貯藏的目的 [1] 。
自從二十世紀七十年代誕生以來, 在短短的幾十年間已得到了迅速的發展和廣泛的應用。它具有從本質上改變生物及食品性能的特性, 因此越來越受到食品科技工作者的重視。基因工程技術在食品領域的應用也取得了豐碩的成果, 并使食品的概念從農業食品、工業食品發展到了基因工程或生物技術食品。可以預言, 在二十一世紀, 以基因工程為核心的生物技術必將給食品工業帶來深刻的革命。
2 基因工程的主要內容
2.1 基因工程的概念
1）狹義的基因工程僅指用體外重組DNA技術去獲得新的重組基因；
2）廣義的基因工程則指按人們意愿設計，通過改造基因或基因組而改變生物的遺傳特性。如用重組DNA技術，將外源基因轉入大腸桿菌中表達，使大腸桿菌能夠生產人所需要的產品。
2.2 基因工程的簡述
基因工程的工具酶在基因工程的操作中起著十分重要的作用，其種類主要有限制性內切酶、連接酶、聚合酶、核酸酶、堿基磷酸酶、逆轉錄酶等，它們正如建筑工程操作中常用的工具一樣，是基因工程操作中必不可少的。
2.3 基因工程操作的基本步驟
1）在供體細胞中用限制性內切酶切割基因，以分離出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制備運載體（質粒、病毒或噬菌體）。其中提取目的基因的方法有直接分離法——鳥槍法，人工合成法包括反轉錄法和根據已知的氨基酸序列合成DNA；
2）把獲得的目的基因與制備好的運載體用DNA連接酶連接組成重組體；
3）把重組體導入受體細胞。在將重組體導入受體細胞前，將細菌用CaCl2處理，以增大細菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質粒進入受體細胞，目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內就能獲得大量的目的基因；
4）目的基因的檢測和表達，并篩選、鑒定出含有外源目的基因的菌體或個體。
3 基因工程技術在食品工業中的應用
3.1 改造食品原材料
轉基因植物源食品 轉基因植物可被改革而具有抗病蟲害的能力,這具有深遠的經濟意義[2] 。1986 年首次獲得能夠抗煙草花葉病毒的轉基因煙草植株,對煙草花葉病毒的預防效果可達70%。目前利用基因工程不斷獲得了各種抗病毒植株,黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒和Y病毒,抗病蟲害長頸南瓜和抗蟲害轉基因土豆。我國及菲律賓培育出“超級水稻”和“超超級水稻”,為人口日益增長、糧食日益短缺的世界帶來一線光明[3] 。遺傳黑胸大蠊濃核工程作為一種改進生物農藥對densoviruses療效可以提高基因操縱。它奠定了基礎為增加作為控制劑廠生產的densoviruses的潛力保護，矢量控制和城市害蟲控制。[4]
3.2 改良食品營養品質
食品中動植物蛋白由于其含量不高或比例不恰當,可能導致蛋白營養不良。采用轉基因的方法,生產具有合理營養價值的食品,讓人們只需吃較少的食品,就可以滿足營養需求。例如,豆類植物中蛋氨酸的含量很低,但賴氨酸的含量很高;而谷類作物中的對應氨基酸含量正好相反,通過基因工程技術,可將谷類植物基因導入豆類植物,開發蛋氨酸含量高的轉基因大豆。胡永金等以南瓜為主要原料，采用保加利亞乳桿菌和嗜鏈球菌(1∶1)進行發酵制作南瓜發酵飲料，通過正交實驗確定發酵最優工藝條件與配方，結果表明，南瓜漿：水(W／W)為1∶1.75、蔗糖添加量為7％、蛋白糖為0.05％、乳酸菌接種量為5％、發酵溫度為40℃、發酵時間為8h，所得到的南瓜汁乳酸發酵飲料產品，其外觀均一穩定，口感酸甜適中，風味獨特[5]。對碳水化合物的改進,只有通過對其酶的改變來調節其含量。高等植物體中涉及淀粉合成的酶類主要有: ADPP 葡萄糖焦磷酸酶(ADP -GPP) 、淀粉合成酶( SS)和分枝酶(BE) 。通過反義基因抑制淀粉分枝酶可獲得完全只含直鏈淀粉的轉基因馬鈴薯。Monsanto公司開發了淀粉含量平均提高了20% - 30%的轉基因馬鈴薯。油炸后的產品更具馬鈴薯風味、更好的構質、較低的吸油量和較少的油味[6]
3.3 改良微生物菌種的性能
發酵工業關鍵是優良菌株的獲取,除選用常用的誘變、雜交和原生質體融合等傳統方法外,還與基因工程結合,大力改造菌種,給發酵工業帶來生機。 面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。Lancashine[將優良酶基因轉入面包酵母菌中后,其含有的麥芽糖透性酶及麥芽糖的含量比普通面包酵母高,面包加工中產生二氧化碳氣體量提高,最終可生產出膨發性良好和松軟可口的面包。應用基因克隆技術將黑曲霉產糖化酶基因cDNA轉入經優化的受體菌(釀酒酵母京龍JL108 號) , 再經反復篩分、馴化獲得JL1(Yip128D117N) ,經包埋制得具有糖化酒化“雙功能”的固定化酵母,載體產酶能力在10u /g·h以上,酒精發酵醪液中酶活達20u /mL以上[7] 。
3.4 開發保健食品和食品疫苗
食品疫苗就是將致病微生物的有關蛋白(抗原)基因,通過轉基因技術導入植物受體中進行表達,得到具有抵抗相關疾病的疫苗。已獲成功的有狂犬病病毒、乙肝表面抗原、鏈球菌突變株表面蛋白等10多種轉基因馬鈴薯、香蕉、番茄的食品疫苗。英國科學家宣布,未來幾年內,他們將培養一種新型生物雞,這種雞所產的雞蛋里具有抗腫瘤因子,癌癥患者食用雞蛋后體內癌細胞的擴散就會受到抑制。收養T細胞療法已經被設想為未來的治療腫瘤的策略,并對幾十年。在某些疾病建立了那樣的背景粗大的惡性腫瘤,收養T細胞療法可能是一個更好的選擇建立了治療性乙肝疫苗治療疾病。收養T細胞療法是一種策略,潛在的提供較好的控制兩者的數量和質量這個T細胞的反應。潛在的臨床療效在人類T細胞療法收養被多次在動物模型中證實,今后將進一步以用于實際。[8]
3.5 改善食品風味
利用基因工程技術還可以生產獨特的食品香味劑和風味劑,如香草素、可可香素、菠蘿風味劑,以及高級的天然色素,如類胡蘿卜素、花色苷素、咖喱黃、紫色素、辣椒素和靛藍等,并且通過雜種選育的色素含量高、色調和穩定性好。例如轉基因的E1coli的玉米黃素最高產量達289μg/g。通過把風味前體轉變為風味物質的酶基因的克隆或通過發酵產生風味物質都可使食品芳香風味得以增強。另外VB2和VC也都有已經商品化的基因工程產品。Henderson等以質粒pE II 13∶1～DpEHBⅡ作為載體，篩選出了具有分解葡聚糖和糊精的啤酒酵母，這種酵母能夠明顯提高麥汁的分解率并改善啤酒質量。陳美珍等以大豆、牛乳為原料，采中性蛋白酶水解后經脫苦、調配制成多肽保健飲料[9]。曾曉雄報道，在紅碎茶加工中添加蛋白酶可使氨基酸含量提高115%，茶紅素提高20%以上，茶褐素明顯下降，使滋味增強且更醇和，湯色變亮，香氣較好[10]。
4 展望
隨著生物化學和分子生物學的進一步發展,基因工程技術在食品工業中的應用日益廣泛,這極大促進食品工業的發展,也為人類最終解決食物短缺、消除饑餓帶來了希望,在食品工業上的應用具有極為廣闊的前景和美好的未來。但對于發展基因工程技術必須持有謹慎的態度,因為這一高新技術的發展也有可能給人類帶來潛在的負面影響。對于基因工程食品來講,在進人市場之前必須經過充分的毒理學鑒定及安全性評價,向消費者確保它們的質量和安全,同時也需要考慮倫理道德方面的因素,充分尊重消費者的生活習慣。現代基因工程技術將為農業帶來新的綠色生命，只有培育出高產的糧食作物及基因工程食品，才能滿足對食物的需求。未來生物技術不僅有助于實現食品的多樣化，而且有助于生產特定的營養保健食品，進而治病健身；在與環境協調方面，生物技術還有助于食品工業的可持續發展。
參考文獻：
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[10]曾曉雄,.酶在茶葉加工中的應用研究現狀與展望。食品工業科技,1993 (5) :25-271.
有關基因工程的論文(13)
基因工程的前景與應用
張峻輝 11512991104
摘要: 從20世紀70年代初發展起來的基因工程技術，經過30多年來的進步與發展，已成為生物技術的核心內容。許多科學家預言，生物學將成為21世紀最重要的學科，基因工程及相關領域的產業將成為21世紀的主導產業之一。基因工程研究和應用范圍涉及農業、工業、醫藥、能源、食品、環保等許多領域。
關鍵詞: 基因工程技術；前景；應用
一、 基因工程的應用
綜述基因工程技術在改善食品原料品質、改良食品工業用菌種和食品加工性能、生產酶制劑和保健食品方面的應用,同時對轉基因食品及其安全性問題進行了總結歸納,最后對基因工程技術在食品中的發展前景進行展望。
以DNA重組為核心內容的基因工程技術是一種新興的現代生物技術。利用基因工程技術不但可以提高食品的營養價值,去除食物原料中的有害成分,同時還可以通過對農作物品種改良,減少種植過程中農藥、化肥等化學品的使用量。目前,經基因工程改造的產品已在農業、醫藥、環保等領域占據了重要的地位,特別是在農業中越來越顯示了它的優越性和發展前景。
農業領域是目前轉基因技術應用最為廣泛的領域之一。農作物生物技術的目的是提高作物產量，改善品質，增強作物抗逆性、抗病蟲害的能力。基因工程在這些領域已取得了令人矚目的成就。
由于植物病毒分子生物學的發展，植物抗病基因工程也也已全面展開。自從發現煙草花葉病毒(TMV)的外殼蛋白基因導入煙草中，在轉基因植株上明顯延遲發病時間或減輕病害的癥狀，通過導入植物病毒外殼蛋白來提高植物抗病毒的能力，已用多種植物病毒進行了試驗。在利用基因工程手段增強植物對細菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大進展。植物對逆境的抗性一直是植物生物學家關心的問題。由于植物生理學家、遺傳學家和分子生物學家協同作戰，耐澇、耐鹽堿、耐旱和耐冷的轉基因作物新品種(系)也已獲得成功。
二、基因工程的前景和展望
由于基因工程運用DNA分子重組技術，能夠按照人們預先的設計創造出許多新的遺傳結合體，具有新奇遺傳性狀的新型產物，增強了人們改造動植物的主觀能動性、預見性。而且在人類疾病的診斷、治療等方面具有革命性的推動作用，對人口素質、環境保護等作出具大貢獻。所以，各國政府及一些大公司都十分重視基因工程技術的研究與開發應用，搶奪這一高科技制高點。其應用前景十分廣闊。我國基因工程技術尚落后于發達國家，更應當加速發展，切不可坐失良機。
但是，任何科學技術都是一把“雙刃劍”，在給人類帶來利益的同時，也會給人類帶來一定的災難。比如基因藥物，它不僅能根治遺傳性疾病、惡性腫瘤、心腦血管疾病等，甚至人的智力、體魄、性格、外表等亦可隨意加以改造；還有，克隆技術如果不加限制，任其自由發展，最終有可能導致人類的毀滅。還有，盡管目前的轉基因動植物還未發現對人類有什么危害，但不等于說轉基因動植物就是十分安全的，畢竟這些東西還是新生事物，需要實踐慢慢地檢驗。轉基因生物和常規繁殖生長的品種一樣，是在原有品種的基礎上對其部分性狀進行修飾或增加新性狀，或消除原來的不利性狀，但常規育種是通過自然選擇，而且是近緣雜交，適者生存下來，不適者被淘汰掉。而轉基因生物遠遠超出了近緣的范圍，人們對可能出現的新組合、新性狀會不會影響人類健康和環境，還缺乏知識和經驗，按目前的科學水平還不能完全精確地預測。所以，我們要在抓住機遇，大力發展基因工程技術的同時，需要嚴格管理，充分重視轉基因生物的安全性。
參考文獻
[1]樓士林，楊盛昌，龍敏南，等.基因工程[M].北京：科學出版社，2002.
[2]張惠展.基因工程[M].上海:華東理工大學出版社, 2005: 1-2.
有關基因工程的論文(14)
論文題目：基因工程原理及進展
課程名稱：化學與人類文明
學 院：
專 業：
年 級：
學 號：
學生姓名：
指導教師：
完成時間：20XX年 XX月XX日
目 錄
一、前 言
二、摘 要
三、關 鍵 詞
四、正 文
1、外源目標基因的分離、克隆及功能結構分析
2、構建能在受體生物細胞中表達的重組目標基因
3、外源重組目標基因的導入
4、轉基因細胞或個體的鑒別和篩選
5、轉基因品系的效益分析
6、生態與進化安全保障
7、消費安全評價
（1）消費安全評價一般要考慮以下一些主要的方面
（2）讓我們來了解一下基因工程在農業、工業及環境保護、醫
藥、食品等方面的應用
（3）我們了解一下基因工程的進展狀況
五、參考文獻
前 言
基因工程是生物工程的一個重要分支，它和細胞工程、酶工程、蛋白質工程和微生物工程共同組成了生物工程。 所謂基因工程（genetic engineering)是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術。是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內，使這個基因能在受體細胞內復制、轉錄、翻譯表達的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質——DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當的工具酶進行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源物質在其中“安家落戶”，進行正常的復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新技術。它克服了遠緣雜交的不親和障礙。
科學界預言，21世紀是一個基因工程世紀。基因工程是在分子水平對生物遺傳作人為干預，要認識它，我們先從生物工程談起：生物工程又稱生物技術，是一門應用現代生命科學原理和信息及化工等技術，利用活細胞或其產生的酶來對廉價原材料進行不同程度的加工，提供大量有用產品的綜合性工程技術。
生物工程的基礎是現代生命科學、技術科學和信息科學。生物工程的主要產品是為社會提供大量優質發酵產品，例如生化藥物、化工原料、能源、生物防治劑以及食品和飲料，還可以為人類提供治理環境、提取金屬、臨床診斷、基因治療和改良農作物品種等社會服務。
基因工程原理及進展
一、摘要:
基因工程技術是一項正在蓬勃發展的技術，它將給人類社會帶來一場深刻的變革，我們有必要了解基因工程的概念、原理、技術程序，以及基因工程在農業、工業、醫藥等方面的應用和進展情況。
Abstract:
Genetic engineering technology is a is the prosperous development of the technology, it will give the human society brought a profound change, we need to understand the concept of genetic engineering, principle, technical procedures, as well as the genetic engineering in agriculture, industry, medicine, and other aspects of the application and progress.
二、關鍵詞: 基因工程 原理 技術程序 應用進展
三、正文：
人類之所以不同于其他動物，是因為人類可以改造自然，使人類與大自然和諧相處。生物工程是運用現代生物科學的理論和方法，按照人類的需要改造和設計生物的結構和功能，以便更經濟、更有效、更大規模地生產人類所需要的物質和產品的技術，它包括基因工程、細胞工程、蛋白質工程、酶和發酵工程。其中基因工程是在遺傳物質的分子水平上改造和設計生物的結構和功能的技術，是一項正在蓬勃發展的技術，它將給人類社會帶來一場深刻的變革。 首先，讓我們來了解一下基因工程的基本原理及技術程序。基因工程的基本原理是在體外將不同來源的DNA進行剪切和重組，形成鑲嵌DNA分子，然后將之導入宿主細胞，使其擴增表達，從而使宿主細胞獲得新的遺傳特性，形成新的基因產物。它有3個基本的步驟：①從合適材料分離或制備目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段與載體連接作成重組DNA分子。③重組DNA分子引入宿主細胞，在其中擴增和表達。不同種類生物的生物學特性不同，其基因工程在操作上和具體技術上必然有所差異，但技術核心都是DNA的重組，即利用一系列的DNA限制性內切酶、連接酶等分子手術工具，在某種生物DNA鏈上切下某個目標基因或特殊的DNA片段，然后根據設計要求，將其接合到受體生物DNA鏈上。一個完整的用于生產生產目的的基因工程技術程序包括的基本內容有：①外源目標基因的分離、克隆以及目標基因的結構與功能研究。②適合轉移、表達載體的構建或目標基因的表達調控結構重組。③外源基因的導入。④外源基因在宿主基因組上的整合、表達及檢測與轉基因生物的篩選。⑤外源基因表達產物的生理功能的檢定。⑥轉基因新品系的選育和建立以及轉基因新品系的效益分析。⑦生態與進化安全保障機制的建立。⑧消費安全評價。 1、外源目標基因的分離、克隆及功能結構分析 獲得合乎人類某種需要的目標基因是開展一項基因工程的前提和全部工作的核心，基因工程的第一步就是獲得目標基因。目前人們已經能夠通過多種途徑和方法來獲取目標基因，比如從構建的基因文庫中調取和篩選目標基因，通過化學方法合成已知核苷酸序列的目標基因，以及通過逆轉錄酶用mRNA為模板合成目標基因等。 2、構建能在受體生物細胞中表達的重組目標基因 要使一個外源目標基因能整合到受體細胞的基因組中并能在整合后在受體基因組的調控下有效地轉錄和翻譯，就必須事先對目標基因的功能結構用DNA重組技術進行適當的修飾，也就是將目標基因與一種特別的DNA分子重組，這種特別的DNA分子稱為基因載體，目前所用的載體主要有以下幾類：質粒、λ噬菌體、柯斯質粒、病毒載體、YAC載體等，各類載體具有獨特的生物學特性，可用于不同的目標基因。 3、外源重組目標基因的導入 將重組的外源目標基因轉入到宿主細胞中的過程稱為基因導入或基因轉移。接受外源基因的細胞稱為受體細胞。由于受體生物學特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因導入的方法也不同，有的是用載體導入，有的是直接用物理的方法導入。目前使用的有轉化、轉染、電穿孔導入法、基因槍射入法、顯微注射法、脂質體介導法等，向細菌等微生物中導入外源目標基因常用質粒轉化和噬菌體轉染方法；向植物細胞中導入外源基因常用基因槍注入法和Ti質粒導入法；能由原生質體再生出植株的植物細胞還可以用電穿孔導入法及脂質體融合法；動物的受精卵一般通過人工顯微鏡注射法導入外源基因；動物的體細胞可用電穿孔法和病毒轉染法導入外源基因，但對用于生產目的的基因工程常常避免用病毒轉染法。 4、轉基因細胞或個體的鑒別和篩選 在對宿主的細胞進行了外源目標基因導入處理以后，有些細胞可能并沒有外源基因的進入，另有一些細胞可能在外源基因進入后因各種原因而不能使外源基因表達，因此必須對被進行了基因轉移處理的細胞或個體進行鑒別，以篩選出導入外源目標基因的轉基因細胞或個體。鑒別和篩選轉基因生物一般在兩個層面上進行：一是檢測目標基因是否表達，二是檢測目標基因是否整合到了宿主的染色體上和能否穩定傳代。表達檢測的方法主要有轉錄產物的印跡雜交法、免疫印跡檢測法、免疫組織化學檢測法等。整合檢測可通過DNA分子雜交來確定。 5、轉基因品系的效益分析 一個生產性能優越的轉基因品系，首要的條件是目標基因的表達產物必須有正常的生理功能，另一個必要標志是其目標基因必須有適度的高效表達特性和可持續生產能力。 6、生態與進化安全保障 由于轉基因生物與其他生物一樣具有可遺傳、易擴散及自主的特性，而且人類對生命、生態系統、生物的演化實際上還知之甚少，對不同物種間基因的人工組合，外源基因對受體生物進化的可能影響，轉基因生物對生態系統的長期影響等都無法進行評估，因此如果人們不事先采取控制措施，轉基因生物一旦進入到自然環境中就可能打破生態平衡，破壞生態環境和自然種質資源。對轉基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通過各種嚴格的管理措施和物理屏障盡量使轉基因生物不能從實驗室逃逸進入到自然環境里去；生物的方法一般就是造成轉基因生物與非轉基因生物之間的生殖隔離，如利用三倍體不育的特性將用于生產的轉基因動物或植物變成三倍體等。 7、消費安全評價 （1）消費安全評價一般要考慮以下一些主要的方面：①導入外源目標基因本身編碼的產物是否安全。②外源目標基因是否穩定。③使用的載體是否安全。④使用的報道基因（就是能產生很容易觀察的性狀的基因）是否會產生有害物質。⑤外源基因導入后是否會誘導受體生物產生新的有害遺傳性狀或不利于健康的成分。為了保護人類的健康，許多國家都已通過立法或其他形式對轉基因產品進行消費安全評價和嚴格的管理，對進口轉基因食品嚴格限制。 （2）讓我們來了解一下基因工程在農業、工業及環境保護、醫藥、食品等方面的應用。隨著生命科學和基因工程技術的進一步發展和完善，越來越多以基因工程改良的植物、動物和微生物品種已經或將要應用于社會生產。農業生產的方式必將發生重大的改變，農產品的產量和質量將大幅度提高；許多高耗能、高污染的化工產業將可能被低耗能、低污染的基因工程產業所取代；經過人工改良的動物、植物和微生物將不但能高效而清潔地生產出醫藥化工所能生產的藥品和試劑，還能生產出醫藥化工所不能生產的效力強大、作用專一的特殊藥品；人體器官培養將成為產業，器官移植將成為臨床常規等。 1、基因工程在農業方面的應用。糧食短缺曾是長期威脅我國人民和世界人民生活的一個最大問題，也仍然是一個沒有從根本上解決的問題。我國的雜交水稻技術使水稻的產量有了大幅度的提高，為解決我國和世界糧食問題做出了巨大的貢獻。最近我國雜交水稻研究中心的科學家與美國科學家的聯合研究發現了一個高光合效率的基因，專家們的分析認為，如果將此高光合效率基因轉移到雜交水稻中，則雜交水稻的產量有可能在原有的基礎上再提高20%。蟲害是降低農作物產量的主要原因之一，全世界每年都因蟲害要損失數千億美元。化學殺蟲劑的長期和大量使用已經產生出許多嚴重的問題，而用基因工程方法培育出的能抗蟲害，不需要施用農藥，對人、畜食用安全的作物，則不僅能提高種植的經濟效益，而且能有效地保護我們的生存環境。我國科研工作者研制的轉Bt毒蛋白基因棉花、轉Bt毒蛋白基因煙草、水稻、楊樹等植物，都有很強的殺蟲效果。基因工程在農業方面的應用前景是相當廣闊的，除了前面說的增產、抗蟲害，還可能培育出能固氮的轉基因作物，能抗旱、抗寒的轉基因植物等。
2、基因工程在工業及環境保護方面的應用。應用基因工程技術，使植物成為能替代微生物發酵設備的生物反應器，更經濟地生產出人類所需要的各種原料已經成為非常具有吸引力的領域。現在已經培育了多種可作為生物反應器的轉基因植物，能產生出可分解的塑料原料、石油、工業用脂肪、糖類和酶類等。經典工業所產生廢水、廢氣和廢料，以及人民生活所產生的垃圾等各種污染物，已經構成對人類生活和生產活動的嚴重威脅。環境保護是人類目前面臨的與人類前途生死攸關的重大問題。基因重組技術為解決這些問題提供了可能性，通過基因重組，人們可以根據需要將某種微生物的基因轉移到另一種微生物中，創造一些對有害物質分解能力更強、更能適應環境要求的新菌種。利用微生物分解各種廢棄物的同時能產生出重要的工業原料是轉基因微生物應用的一個重點，植物的纖維素和木質素是木材工業中常見的廢棄物，人們可利用轉基因微生物來分解纖維素，生產工業用的原料，如乙醇等石油化工產品。許多低耗能、少污染的基因工程逐漸取代高耗能、高污染的化工產業已成為一種趨勢。 3．基因工程在醫藥方面的應用。在醫藥方面，基因工程主要用來生產各種重要的人蛋白藥物，迄今為止，人們已經分離和克隆了300多種不同的人用蛋白藥物的基因，其中有數十種基因已經在不同的宿主中進行了表達和對其表達產物進行了功能分析和檢測，有20多種經批準已經投放市場，如通過轉基因微生物生產的干擾素、胰島素、人和動物用生長激素等。胰島素是最早通過轉基因微生物生產的蛋白藥物。人們將編碼胰島素A鏈和B鏈的基因編碼序列分別克隆到細菌質粒載體上，并都與半乳糖苷酶基因串聯在一起。由細菌中分開合成的蛋白質是都連接有半乳糖苷酶的胰島素A鏈和B鏈。純化和收集合成產物后用溴化氰處理除去半乳糖苷酶，然后再用磺酸處理，就可以使A鏈和B鏈通過二硫鍵連接到一起而組成完整的胰島素。人們還在嘗試用轉基因哺乳動物如牛、羊的乳腺作為生物反應器，高效生產人類所需要的蛋白藥物。有人還將人的珠蛋白基因的調控區與人的兩個1珠蛋白基因和一個珠蛋白基因重組在一起，轉移到豬的受精卵中，得到的轉基因豬在血液中出現了人的血紅蛋白，也許在不久的將來，人們便可以用轉基因豬生產的人血紅蛋白來輔助輸血。豬的各種器官的大小與人類的器官比較一致，有人設想用基因工程的方法改造豬的某些器官的抗原特性，以生產出用于人類醫療移植的器官，解決器官來源的問題。我們期待著基因工程能給人類帶來更健康的生命、更富足的物質、更舒適的環境。 （3）我們了解一下基因工程的進展狀況。基因工程技術是一項正在蓬勃發展的技術，而且也已經取得了許多重要的應用成果，但我們也應該看到，基因工程技術不是一項已經成熟的技術，仍然還很粗糙和原始，在許多方面尚需完善和改進。 1．基因工程在技術上存在一定的不確定性和盲目性。目前的基因工程在技術上有很多的不確定性。這種不確定性表現在兩個方面，一是技術方面的不穩定性，二是由于對不同生物的生理特性的了解不很深入，如我們將魚類抗凍蛋白基因轉移到不抗寒的羅非魚等熱帶魚中，雖然抗凍蛋白基因得到表達，但并沒有使受體魚產生預期的抗寒效果。目前我們所進行的基因工程基本上只能對簡單的、單基因控制的性狀進行設計和改造，操作對象只限于一些比較簡單的單因子基因。但生物絕大部分的重要性狀是由多個基因共同控制的，對這些多基因控制的性狀，現有的基因工程技術幾乎仍然是束手無策。我們對活的生物體中基因表達調控的機制知之甚少，有關的知識僅限于對啟動子和增強子有所了解，對生物體整體的調節復雜性的認識還剛剛開始。 2．在安全性方面存在著不確定性。對社會大眾來說，最主要和最關心的是基因工程的安全性問題，基因工程的安全性問題包括兩個方面：一是基因工程產品的消費安全問題，二是轉基因生物的生態安全問題。目前用轉基因技術生產出來的食品因其成分的某些改變是否會對人類的健康產生不良的影響，這需要實驗和時間來驗證。有著某種生存優勢的轉基因生物如果進入到自然生態系統，就有可能排擠自然種群，降低生態系統里物種的多樣性，打破生態平衡。 所以我們在大力發展轉基因技術的同時，必須高度重視對轉基因動物、植物及微生物品種的生物控制和控制技術的研究。在轉基因品種的安全性沒有進行全面的評估和沒有可靠的生物控制措施之前，應嚴格禁止其進行生產和進入開放的自然生態系統，只有其生態安全性達到了傳統育種方法培育的新品種時，或無生殖能力的轉基因動物和植物才能允許進入自然界進行生產，也只有這樣才是有益于人類和社會進步的。
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有關基因工程的論文(15)
淺析基因工程技術的應用現狀
動物醫學專業
任課教師 指導教師姓名
摘要: 基因工程作為一門理論性與實踐性較強的學科,其方法與技術已經滲透到現代生命科學的各個分支領域,成為生命科學的一門核心技術。基因工程包含許多獨特的實驗方法和技術,不僅內容豐富,涉及面廣,實用性也強。基因工程是通過DNA 重組技術, 獲得具有特殊生物遺傳性狀和功能的遺傳工具生物體, 基因工程技術廣泛應用于農業、醫學、食品工業等。本文就基因工程的應用現狀綜合闡述。
關鍵詞 : 基因工程; 應用現狀
Shallow gene engineering technology application status
Student majoring in Veterinary Medicine Yinxunqiang
Tutor Minlingjiang
Abstract: Genetic engineering as a door the theory with practical strong subject, the method and technology has penetrated into the modern life science of each branch, become life science and a core technology. Genetic engineering contains many unique experiment method and technique, not only rich content, broad and practical also strong. gene engineering is obtained through DNA recombinant technology, with special biological genetics and function of the genetic tools organisms, genetic engineering technology, widely used in agriculture, medicine, food industry etc. This paper genetic engineering application status of comprehensive elaboration.
Key words: gene engineering, DNA recombinant technology,Application status
0.前言
基因工程技術是一項極為復雜的高新生物技術, 它利用現代遺傳學與分子生物學的理論和方法, 按照人類所需, 用DNA 重組技術對生物基因組的結構和組成進行人為修飾或改造, 從而改變生物的結構和功能, 使之有效表達出人類所需要的蛋白質或人類有益的生物性狀[1]。基因工程從誕生至今, 僅有30 年的歷史, 然而, 無論是在基礎理論研究領域, 還是在生產實際應用方面, 都已取得了驚人的成績。首先,基因工程給生命科學自身的研究帶來了深刻的變化。目前科學家已完成了多種細胞器的基因組全序列測定工作。其次, 基因工程具有廣泛的應用價值, 能為工農業生產、醫藥衛生、環境保護開辟新途徑。
1.基因工程
1.1 概念
基因工程( 又稱DNA 重組技術、基因重組技術) , 是20 世紀70 年代初興起的技術科學, 是用人工的方法將目的基因與載體進行DNA重組, 將DNA 重組體送入受體細胞, 使它在受體細胞內復制、轉錄、翻譯, 獲得目的基因的表達產物。這種跨越天然物種屏障, 把來自任何生物的基因置于毫無親緣關系的新的寄主生物細胞之中的能力, 是基因工程技術區別于其他技術的根本特征。
1.2 基因工程研究內容
(1) 從復雜的生物有機體基因組中, 經過酶切消化或PCR 擴增等步驟, 分離出帶有目的基因的DNA 片段。
(2) 在體外, 將帶有目的基因的外源DNA 片段連接到能夠自我復制并具有選擇記號的載體分子上, 形成重組DNA分子。
(3)重組DNA 分子轉移到適當的受體細胞, 并與之一起增殖。
(4) 從大量的細胞繁殖群體中, 篩選出獲得了重組DNA 分子的受體細胞克隆。
(5) 從這些篩選出來受體細胞克隆, 提取出已經得到擴增的目的基因, 供進一步分析研究使用。
(6) 將目的基因克隆到表達載體上, 導入寄主細胞, 使之在新的遺傳背景下實現功能表達, 產生出人類所需要的物質。
2.基因工程的廣泛應用
2.1 在農業上的應用
2.1.1 抗除草劑的植物基因工程
資料表明, 每年雜草造成的經濟損失占農作物總產值的10%-20%左右盡管除草劑的使用, 對大規模機械化耕作, 減少勞力開支和提高量有極為重要的作用, 但一般除草劑的選擇性較差, 即除了殺草以外, 還會將作物殺死。現在利用生物技術, 將能抵抗除草劑的基因轉移到植物中, 獲得抗除草劑的植物, 如美國的孟山都公司將除草劑草甘磷的靶酶( EPSPS) 的cDNA 克隆轉入油菜[2] , 目前, 已獲得的抗除草劑作物有大豆、棉花、玉米、水稻和甜菜等20 多種。
2.1.2 抗蟲的植物基因工程
生物防治害蟲的工作已經開展多年, 主要是利用蘇云金桿菌中的毒蛋白( 結晶蛋白) 對害蟲有毒害作用, 使用這些桿菌來控制害蟲。現在, 人們可以通過克隆這些毒蛋白的基因(Bt 基因) 并把這些基因轉移到植物細胞中, 從而獲得能抗蟲的轉基因植物。目前, Bt 基因已被轉入煙草、番茄、馬鈴薯、水稻、玉米及棉花等多種植物中。1996 年轉Bt 基因棉花在美國種植66 萬hm2 經中國農科院棉花所引進在華北試種兩年, 在多點表現突出, 在完全不噴殺蟲劑的情況下, 單產仍然高于噴撒2- 3 次殺蟲劑的中國推廣棉花[3] , 顯示出了控制棉鈴蟲的極好前景。
2.1.3 動物轉基因育種
動物基因工程研究主要集中在改良家畜、家禽的經濟性狀和通過轉基因動物進行藥物或蛋白質的生產等方面, 目前已取得了顯著的成就, 先后培育出轉基因豬、羊、牛和魚等, 另一種轉基因豬是帶有人體基因的豬, 這種轉基因豬客望能解決人體移植動物器官的遺體排斥問題。隨著動物基因工程技術的逐漸成熟和轉人體血紅蛋白的基因豬、轉人體血清蛋白的基因山羊等的問世, 不僅能生產出大量人類所需的血紅蛋白、白蛋白等藥物而且為動物育種開辟了一條全新的途徑。
2.2 在醫學上的應用
2.2.1 基因工程藥物
利用基因工程技術開發新型治療藥物是當前最活躍和發展最快的領域。自1982 年世界第一個基因工程藥物- - - 重組胰島素投放市場以來, 基因工程藥物就成為制藥行業的一支奇兵, 每年平均有3- 4 個新藥或疫苗問世, 開發成功的約50 個藥品, 諸如人胰島素、忍尿激酶、人生長激素、干擾素、激活劑、乙肝疫苗等廣泛應用于治療癌癥、肝炎、發育不良、糖尿病和一些遺傳病上, 在很多領域特別是疑難病癥上, 起
到了傳統化學藥物難以達到的作用[4, 5, 6]。為治愈癌癥正在研制的用單克隆抗體制成的“生物導彈”, 就是按照人類的設計, 把“生物導彈”發射出去, 精確的命中癌細胞, 并炸死癌細胞, 而不傷害健康的細胞, 比如專門用于腫瘤的“腫瘤基因導彈”等。可見, 生物工程藥物將成為21世紀藥業的支柱。而脫氧核糖核酸或者基因疫苗的問世, 變革了機體的免疫方式。如今, 人們翹首關注困擾人類的艾滋病病毒疫苗的早日問世。
盡管目前誘變育種技術仍是改良微生物工業生產菌種的主要手段,但是基因工程技術在改良工業生產菌種方面已有成功的報道。最常見的是將控制藥物合成關鍵步驟的酶基因克隆,通過適當的載體轉移到原生產菌中,以使控制限速步驟的酶水平,從而提高產量。Malmberg等[7]構建了一種帶有編碼賴氨酸ε-氨基轉移酶基因( lysine-ε-aminotranster-ase,LAT)這種控制Streptomyces clavuligerus生物合成頭霉素C的限速步驟的關鍵酶的基因(lat)的高拷貝質粒,并轉入這種頭霉素產生菌,使LAT提高活力提高了4倍,在2 L發酵罐中產生頭霉素的能力是原來的2倍,重組菌胞外LAT產物α-氨基己二酸的積累量也比原受體菌高。伊維菌素( ivermectins)是一個市場很大的抗蟲
抗生素,其前體阿弗米丁(avermectins)的產生菌種的發酵液中有8個以上的組分,其中只有B1a組分才是制備伊維菌素的原料。Ikeda等[8]經過近十年的努力,已將阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清,并經過誘變與DNA重組,獲得了僅產阿弗米丁B2a單一組分和B1a、B2a組份的重組工程菌,這不僅大大提高了阿弗米丁有效組分的發酵效價,且給提取、精制、半合成等后處理工序帶來了很大的便利。可以預見,隨著對各種工業生產的微生物藥物生物合成途徑的深入了解以及基因重組技術的不斷進展,應用基因工程方法定向構建高產菌株的成功實例將越來越多。在抗生素發酵過程中供氧往往是一個限制因素,充足的氧氣供給是藥物工業發酵穩定和提高產量,降低成本的關鍵。傳統的解決方法如增加通氣量等對設備要求高,能量消耗大。20世70年代末在專性好氧菌透明顫(Vitreoscilla)中發現了血紅蛋白(VHb),它能促進氧氣擴散到細胞末端氧化酶上。于是人們想到了將其基因Vgb克隆到其它微生物中,以促進微生物在低氧條件下生長。
1988年Khosla等[9]從Vitreoscilla中分離出Vgb基因并將之轉入大腸桿菌(E·coli),提高了大腸桿菌在溶氧量低于5%時對氧的利用率。目前已用克隆表達VHb的方法提高了放線紫紅素、頭孢霉素C、紅霉素等產生菌及青霉素酰化酶基因工程菌的產量[10]。血紅蛋白基因工程的研究和應用,必將對抗生素工業和其它重組藥物發酵工業的節能等帶來美好的前景。作為半合成頭孢菌素類抗生素重要原料的7-氨基頭孢烷酸（7-ACA),目前國內外仍以化學裂解頭孢菌素C的工藝路線為主。國內外已報道可用經由GL-7-ACA的二步法(化學/酶法或二步酶法)來生產7-ACA,與化學裂解法相比不僅收率提高,且能大大減少環境污染,簡化生產工藝。但二步法中關鍵的GL-7-ACA酰化酶在假單胞菌中表達量低而且分離純化困難,限制了這種方法的應用。通過將GL-7-ACA酰化酶基因轉入大腸桿菌中表達恰好可以解決這一問題[11]。最近又報道可將編碼2個酶的基因直接轉入頭孢菌素C的生產菌種中,使其在發酵時直接產生7-ACA。調節基因在藥物的生物合成中也起著重要作用,增加調節基因的基因量能夠大幅提高藥物產量。 Hopwood等將放線紫紅素生物合成的一個調節基因actⅡ導入原產生菌,盡管基因的拷貝數僅增加了2倍,放線紫紅素的產量卻增加了30~40倍。某些抗生素生產菌的產量不高,是由于其自身對該抗生素的抗性不高。因此,利用高拷貝質粒的基因量效應,增加菌種對自身產生的抗生素的抗性,可能增加抗生素的產量。例如,將氨基糖苷-6-乙酰轉移酶基因導入卡那霉素和新霉素產生菌,由于提高了對氨糖類抗生素的抗性,產量提高了2~6倍
2.2.2 基因治療
基因治療是指由于某種基因缺陷引起的遺傳病通過轉基因技術而得到糾正。臨床實踐已經表明: 基因治病已經變革了整個醫學的預防和治療領域。比如白癡病, 用健康的基因更換或者矯正患者的有缺損的基因, 就有可能根治這種疾病。現在已知的人類遺傳病約有4000種, 包括單基因缺陷和多基因的綜合癥。運用基因工程技術或基因打靶的手段, 將病毒的基因殺滅, 插入矯正基因, 得以治療、校正和預防遺傳疾病的目的。目前, 基因治療已擴大到腫瘤、心血管系統疾病、神經系統疾病等的治療[12]。人類也已成功實現了腎、心、肝、胰、肺等器官的移植, 也有雙器官和多器官的聯合移植。
基因治療有兩種途徑: 一是體細胞的基因治療, 一是生殖細胞的基因治療。由于生殖細胞的基因治療操作技術異常復雜, 又涉及倫理緩行之理充足, 故尚無人涉足[13]。基因工程是20 世紀生命科學中最偉大的成績, 開辟了生命科學的新紀元。經過幾十年的發展, 基因工程技術已成為一個巨大的朝陽產業, 它可以超越動物、植物、微生物之間的界限, 創造出新的生物類型。基因工程不僅在醫學上應用廣泛, 而且也廣泛應用在工業、農業、冶金、環保、資源、能源、畜牧漁業等領域, 為人類的豐衣足食和健康長壽提供了持續的實用價值很高的產品, 發展前景極為廣闊。
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有關基因工程的論文(16)
XX農業大學選修課論文課程名稱 生態信息學概論論文題目 談基因工程技術如何應用于植物
所在學院 專業班級 學號 姓名 指導老師XXXX年5月9日
分子生物學
—談基因工程技術如何應用于植物
摘要：通過基因工程改良品種在未來的農業生產中日益顯示出巨大潛力。盡管科學家們對轉基因植物的爭論仍在繼續，但可以肯定的是，轉基因植物作為一項新興的生物技術的產物，在解決日益膨脹的地球人吃飯問題和在解決長期困惑人類發展的資源短缺、環境惡化、經濟衰退三大難題中起著越來越重要的作用。本文綜述了基因工程技術在植物中的應用，就轉基因植物的技術、發展、安全性和發展前景作了探討。
關鍵詞：基因工程技術；轉基因植物；安全性；發展前景
所謂轉基因植物是指利用基因工程技術，在離體條件下對不同生物的DNA進行加工，并按照人們的意愿和適當的載體重新組合，再將重組DNA轉入生物體或細胞內，并使其在生物體內或細胞內表達的植物。自1983年首次獲得轉基因植物以來，轉基因技術發展十分迅速，成功的轉基因植物已達60多種，在世界上批準進入田間試驗的轉基因植物已超過500例。
1植物的轉基因技術
由于植物的體細胞具有全能性，即單個的細胞經過合適培養后可以生成完整的植株。將分離能夠編碼所需產物的DNA片段克隆到適當的載體DNA中形成重組DNA，利用細菌繁殖擴增重組DNA并將重組DNA中的目的基因導入所需的培育的植物細胞中，篩選出所需要的細胞，通過細胞的全能性將轉基因植株大規模種植。
其中外源基因導入植物細胞的方法可分為DNA直接轉化和以載體為媒介的基因轉化。基因的直接轉移是通過物理化學法將外源基因轉入受體植物細胞的技術。常用的方法有化學刺激法、脂質體法、顯微注射法和基因槍法等。其原理是利用物理化學方法暫時改變膜通透性，使DNA進入細胞，并最終整合到植物基因組中。
以載體為媒介的基因轉化即使通過農桿菌或植物病毒介導感染受體植物將外源基因轉入植物細胞的技術。目前，載體法主要包括土壤農桿菌Ti質粒、Ri質粒及植物DNA病毒等介導的遺傳轉化法。
2轉基因植物的篩選與檢測
通過轉基因的方法將目的基因轉入目的植物的細胞后，轉化細胞與非轉化細胞相比都只占少數，兩者存在競爭，而轉化細胞的競爭力通常比非轉化細胞弱，因此必須對轉化細胞進行篩選和檢測。
在構建重組DNA時，人們已經引入了標記基因以對轉化子選擇和鑒定。報告基因由于其表達產物易于檢測，已廣泛用于轉基因植物中。根據報告基因編碼特點，大致分為兩類：抗性基因和編碼催化人工底物產生顏色變化的酶基因或發光基因。根據檢測的不同階段區分，有DNA檢測法、RNA檢測法及蛋白質檢測法。DNA檢測法只能檢測到外源基因是否已經整合到植物基因組中，而RNA檢測法得到的結果可判定外源基因是否轉錄，蛋白質檢測法則可檢測出外源基因是否翻譯。
3改進轉基因的技術
隨著植物轉基因技術的創立和發展，許多具有重要經濟價值的農作物獲得了轉基因植株，植物轉基因技術成為植物育種的一個重要手段，但仍有許多問題阻礙了轉基因技術在生產上的廣泛的應用。將外源DNA導入植物細胞后，只有外源DNA在宿主細胞及其子代細胞中穩定整合和有效的表達，才能培育出具有新的遺傳性狀的轉基因植物。大量研究表明外源基因在轉基因植物中有的能正常表達，有的表達量很低，甚至不表達，而且在不同的植株個體之間也存在著明顯差異。所以提高轉基因的表達，減少轉基因的失活是轉基因技術的一個重要內容。
提高外源基因表達水平的措施有:
3.1農桿菌介導的遺傳轉化方法由于其產生的拷貝數相對較少，可以在一定程度上避免這個問題。
3.2使用信號肽，每種植物蛋白質的作用空間位置都是不同的，蛋白質分子的定向運輸需要特殊多肽信號的引導作用。
3.3選擇強啟動子和誘導型啟動子
3.4使用強終止子 常用的終止子時CaMV35S終止子和根瘤土壤桿菌T-DNA的胭脂氨基酸合成酶基因的nos終止子。
3.5消除甲基化的影響 在載體上加上去甲基化功能的序列以防止甲基化。
3.6使用植物偏愛的密碼子
3.7使用MAR序列
3.8使用增強子
3.9對外源基因進行修飾和改造
3.10以葉綠體作為轉化受體
3.11使用一些病毒編碼蛋白
3.12在有性生殖后代中篩選單拷貝植株
4基因工程在農作物上的應用
4.1抗蟲轉基因作物 最早獲得的轉Bt（蘇云金桿菌）毒素基因植物是煙草和番茄，隨后Bt毒素基因相繼被轉化到許多其他農作物中，如棉花、水稻、玉米等，獲得了一大批具良好抗蟲性的轉基因植物品種。
4.2抗病毒作物 植物病毒感染時一個嚴重的問題，它可導致農作物生長緩慢、產量降低和質量減退。轉基因植物的成功使作物抗病毒成為可能并加速了作物抗病育種的研究進程。自1986年Powel-Abel首次將煙草花葉病毒（TMV）外殼蛋白（Cp）基因導入煙草，培育出抗TMV植株以來，已經將許多 病毒成功的構建了多種抗病毒植株，近幾年的研究結果表明病毒外殼蛋白在系統雜交保護中起著重要的作用，插入一段已克隆的CP基因可以延緩病毒的發展和阻止病毒在轉基因植株中進一步傳播。
4.3抗細菌和真菌作物 細菌和真菌病在全部植物病害中造成的損失最大，很多科學家都在嘗試從植物的生物體內尋找抗病原菌的蛋白及其基因，并將其用于植物基因工程。自1980年，瑞典科學家首次從美國惜古比天蠶種成功分離了3種誘導型的殺菌肽進行了深入的研究。它們對很多種植物病原菌有較強的殺傷作用。現在的實驗結果表明，殺菌肽作用于細胞的細胞膜，破壞膜的完整性，造成離子通道，最終導致細胞內含物泄露。目前，殺菌肽基因工程已經在煙草、馬鈴薯等植物上有了初步報道。
4.4抗除草劑轉基因作物 人類自有農業起就一直跟雜草作斗爭，它是農業生產中的大敵，但由于它具有較強的生態適應性和抗逆性，所以給雜草的防治帶來了困難。在大量使用化學除草劑的同時往往會對作物造成一定的傷害。為此人們在研究抗除草劑基因，將該基因轉入植物，在噴施除草劑殺死雜草時，不傷害作物。20世紀80年代中期，抗除草劑基因被轉入了作物體內，從而獲得了抗除草劑的轉基因大豆、棉花、玉米、油菜、小麥等。
4.5抗非生物脅迫作物 干旱時困擾農業生產的重要因素之一，它給農業生產帶來巨大的損失，這種損失甚至是毀滅性的。CMO基因是合成乙酰-甜菜堿第一步反應關鍵酶的基因，具有很強的抗旱性。Rathinasabathi等獎煙草中的CMO基因導入水稻中，獲得抗旱性較強的轉基因水稻。可以相信在未來培育出的耐旱的新作物品種應該是轉入多種共同作用的外源基因。
5轉基因植物的安全性
.. 5．1轉基因植物的優缺點 關于轉基因植物及其安全性問題，是近年來的熱
門話題，但目前國際上沒有統一說法，爭論不一。其主要優點：①增加食物供應，解決糧食短缺；②減少農藥使用，避免環境污染；③降低生產成本，降低食物售價；④增加食物營養，提高附加價值；⑤增加食物種類，提升食物品質；⑥提高生產效率，帶動相關產業發展。其主要缺點：①可能對蝴蝶等昆蟲造成傷害；
②可能影響周邊植物的生長；③可能使昆蟲或病菌在演化中增加抵抗力或產生新的物種，因此有可能會傷害作物。..
5．2轉基因食品的安全性和可接受性
隨著轉基因技術的發展，轉基因食品的安全性越來越受到人們的關注。轉基因食品與傳統食品相比，區別在于：首先它含有利用轉基因技術導人的外源基因；其次可能存在外源基因在受體內的表達產物。由于這兩種成分的不確定性以及由此引起的次級效應，對人類健康可能有潛在的危害。目前人t fx轉基因食品生物的擔憂基本上可以歸納為3類：( 1)轉基因食品里加入的新基因無意中對消費者造成的健康危害；( 2)轉基因作物中的新基因對食物鏈其他環節無意中造成的不良后果；( 3)人為強化轉基因作物的生存競爭性，對自然界生物多樣性的影響。其中人們最為擔心的是轉基因食品對人體健康是否安全，轉基因食品與常規食品比較有無不安全的成分。這就需要對其主要營養成分、微量營養成分、抗營養因子的變化、有無毒性物質、有無過敏性蛋白以及轉入基因的穩定性和插入突變進行檢測。另外是人們對.. “基因逃逸”的擔心。所謂.. “基因逃逸”，就是指微生物之間可以通過轉導、轉化、接合進行基因轉移。人們主要是擔心轉基因作物及基因食品的有害基因是否會逃逸到人體或環境中，加快抗藥性問題。如野生植物種通過受粉可能會完成抗除草劑的基因改良，會變成.. “超級雜草”，由此形成的具有非自然抗逆性的植物對那些以其為生的動物們來說，可能會導致生物鏈的斷裂。
6轉基因植物的發展前景 轉基因植物在人類發展史上，是人類對自然的認識和改造的結果，必將對人類的生存帶來重大影響。隨著人們對遺傳本質認識的深化和生物技術水平的不斷提高，大量的轉基因植物不斷涌現。通過轉基因技術來改良作物的品質是一個不可阻擋的趨勢，因為現在有許多問題是無法通過常規育種來解決的，特別是耐旱、耐貧瘠等作物品種的培育。例如非洲的沙漠地區，如果按照現在的育種手段，它的糧食產量根本不可能滿足基本生活保證，人們現在
寄希望于通過轉基因技術生產一些比較耐旱、耐貧瘠的作物，以解決因為土地可耕面積的減少而給人類帶來的壓力。另外，轉基因技術可以改良作物的營養成分，現在非常知名的一個例子就是瑞士聯邦技術研究所成功開發的金色大米，它是通過將胡蘿卜素合成途徑的關鍵基因轉到水稻中去，生產出的大米是金黃色的，這種水稻含有VA的合成原料，在解決吃飯問題的同時有助于治療因缺乏VA而導致的眼睛失明等疾病，這對于發展中國家非常重要。因此轉基因技術具有廣闊的發展前景。但是，在大力發展轉基因食品的同時，應建立完善的轉基因產品評價和監控體系。1 993年，世界經濟合作與開發組織發表了.. “現代生物技術食品的安全評價——概念和原則”，提出了.. “質量等同性概念”，其含義是.. “當某個由轉基因技術生產的新食品的各項主要特征(分子學特征、遺傳形狀、主要營養成分等)與現有食品大致相同，則認為該新食品的安全性也與現有食品大體等同。”我國政府也于1 993年、1 996年和2 001年分別頒布了有關條例和規定，要求對轉基因食品的試驗、生產、應用等實行生產許可證和經營許可證制度，同時對違規試驗、生產、應用、進出口轉基因食品的機構和人員，規定了嚴厲的處罰措施。但如何維護消費者的知情權，對轉基因食品實行標志制，如何加強對進口轉基因食品的檢驗監管，保證我國的食品衛生安全等尚需進一步完善，加強研究。
綜上所述，基因工程技術作為一項新興的生物技術，其發展趨勢不可阻擋。但科學技術是把雙刃劍的理論同樣適合轉基因植物。為此，我們應該適當借鑒國外經驗，建立一套既符合中國國情，又與國際接軌，且科學合理的基因安全評價和監控體系，為日后我國轉基因植物走向世界奠定基礎。
有關基因工程的論文(17)
姓名：董道保
學號：2010107050
目錄
1 基因的概述 3
2 什么是基因的遺傳效應？ 3
3 基因克隆 3
4 基因克隆的過程 4
4.1目的DNA片段的獲得 4
4.2載體的選擇 4
4.2.1復制和表達 5
4.2.2分子量盡 5
4.2.3遺傳標記 5
4.2.4 酶切位點 5
4.2.5 常用的載體 5
4.3體外重組 5
4.4導入受體細胞 6
4.5重組子的篩選 6
4.5.1 插入失活法 6
4.5.2 PCR篩選和限制酶酶切法 6
4.5.3 核酸分子雜交法 6
4.5.4 免疫學篩選法 7
基因克隆技術
隨著轉基因技術的發展，獲取目的基因片段的方法也越來越多樣化，獲取目的基因片段的技術也日新月異，但是無論獲取的方法和手段怎么樣發展，獲取的主要思路始終在圍繞一根主線在開展。
關鍵詞 基因 ，遺傳效應，基因克隆，體外重組，載體
1 基因概述基因是細胞內DNA分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應的DNA分子片段。基因控制蛋白質合成，是不同物種以及同一物種的不同個體表現出不同性狀的根本原因。基因通過DNA復制及細胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制蛋白質的合成使遺傳信息得到表達。
2 什么是基因的遺傳效應？基因的遺傳效應就是對蛋白質合成有直接或間接影響的部分，有遺傳效應的DNA片段就是能夠直接指導或間接調控蛋白質合成的堿基序列。科學家發現，人體每個體細胞染色體DNA上共有堿基對三十億個，其中絕大部分遺傳信息并不會表達出來，同時對性狀也沒有直接的影響，這些我們稱之為沒有遺傳效應的DNA片段，反之即為有遺傳效應，稱為基因。基因分編碼區和非編碼區兩部分，編碼區可直接指導或調控蛋白質的合成，而非編碼區只能調解蛋白質的合成，但是無論是非編碼區還是編碼區對于生物性狀的正常表達來說都是不可或缺的，因此都是基因的一部分，也就都有遺傳效應。
3 基因克隆美國斯坦福大學的伯格（P.Berg）等人于1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產生了一種新的重組DNA分子，從此產生了基因克隆技術。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質粒DNA連接起來，構成了一個重組質粒，并將該重組質粒轉入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。
一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術以及基因工程等。
可概括為∶分、切、連、轉、選。
"分"是指分離制備合格的待操作的DNA，包括作為運載體的DNA和欲克隆的目的DNA；
"切"是指用序列特異的限制性內切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；
"連"是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；
"轉"是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細胞中進行復制和擴增；"選"則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體。
基因工程技術的兩個最基本的特點是分子水平上的操作和細胞水平上的表達，而分子水平上的操作即是體外重組的過程，實際上是利用工具酶對DNA分子進行"外科手術"。
4 基因克隆的過程DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此DNA克隆又稱分子克隆，基因操作或重組DNA技術。DNA克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導入宿主細胞技術和重組子篩選技術等等。
4.1目的DNA片段的獲得DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群DNA分子，這些DNA分子或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉錄合成的雙鏈 cDNA分子。由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組DNA 或cDNA中通過PCR技術可以獲得目的基因。
4.2載體的選擇基因工程的載體應具有的一些基本的性質：
4.2.1復制和表達
基因在宿主細胞中應該有獨立的復制和表達的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。
4.2.2分子量
基因的分子量盡可能小，有利于在宿主細胞中有較多的拷貝，便于結合更大的外源DNA片段。同時在實驗操作中也不易被機械剪切而破壞。
4.2.3遺傳標記
載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記，以賦予宿主細胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。
4.2.4 酶切位點
載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點是位于檢測表型的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利于重組子的篩選。
4.2.5 常用的載體
質粒載體，噬菌體載體，柯斯質粒載體，單鏈DNA噬菌體載體，噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。
4.3體外重組體外重組技術就是在體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割DNA分子形成有粘性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為粘末端連接。當目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比粘端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有粘末端的表達載體實現表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應的粘末端，然后進行連接，此為修飾粘末端連接。各種連接策略間的關系總結如下：
4.4導入受體細胞載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復制起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。
將外源重組DNA分子導入原核宿主細胞的方法有轉化，轉染，轉導。重組質粒通過轉化技術可以導入到宿主細胞中，同樣重組噬菌體DNA可以通過轉染技術導入。轉染效率不高，因此將重組噬菌體 DNA或柯斯質粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，借助這些噬菌體顆粒將重組DNA分子導入到宿主細胞轉導技術，這種轉導技術的導入效率要比轉染的導入效率高。
4.5重組子的篩選從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。
4.5.1 插入失活法
外源DNA片段插入到位于篩選標記基因的多克隆位點后，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉化子是重組子或非重組子。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法。
4.5.2 PCR篩選和限制酶酶切法
提取轉化子中的重組DNA分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過PCR技術篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。
4.5.3 核酸分子雜交法
制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。
4.5.4 免疫學篩選法
獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以采用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。
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